Лизирующие ферменты. Ферментные препараты
Введение к работе
Состояние вопроса и актуальность проблемы
Литические ферменты*, разрушающие клеточные оболочки бактерий, были впервые обнаружены в слюне человека и описаны Александром Флемингом в 1922 году (Fleming, 1922). Вещество назвали лизоцимом, что означает «фермент, растворяющий бактерии». В 1929 г. Флеминг впервые описал антибактериальные свойства гриба Penicillum notatum - продуцента первого промышленного антибиотика пенициллина, за что в 1945 г. в соавторстве с Эрнестом Чейном и Говардом Флори был награжден Нобелевской премией. После выпуска пенициллина и до настоящего времени проводится постоянная работа по созданию и производству новых антибиотиков, что вызвано не только необходимостью получать вещества требуемой специфичности и лучшего качества, но также постоянным появлением патогенных микробов, устойчивых к любому, даже самому новому антибиотику (). Сложившаяся в связи с этим неблагоприятная ситуация в терапии инфекционных заболеваний заставляет искать новые эффективные антимикробные средства. Многие исследователи указывают на перспективность использования в этих целях литических ферментов, так как способ их воздействия на микробы, а именно растворение микробной клетки, позволяет надеяться на отсутствие появления устойчивых к ним патогенов.
* Термином «литические ферменты» сейчас обозначают гидролазы, разрушающие структурные полимеры клеточных стенок различных микроорганизмов. В зависимости от того, какие именно микроорганизмы они разрушают, литические ферменты разделяют на бактериолитические, дрожжелитические, миколитические. По субстратной специфичности они могут быть подразделены на хитиназы, протеазы, пептидогликангидролазы, глюканазы. Это зависит от того, какие полимеры, входящие в состав клеточных оболочек разных микроорганизмов, разрушают литические ферменты. В свою очередь, например, пептидогликангидролазы, разрушающие пептидогликан - структурный компонент клеточных стенок бактерий, в зависимости от того, какую связь в молекуле пептидогликана они гидролизуют, разделяются на гликозидазы (N-ацетилглюкозаминидазы и N-ацетилмурамидазы (лизоцимы)), амидазы и эндопептидазы. Следует особо отметить бактериолитические протеазы. Среди большого количества известных в настоящее время протеаз бактериолитических совсем немного. Но именно эти ферменты в группе литических обладают самым широким спектром действия в отношении микроорганизмов. Они способны разрушать клеточные оболочки бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, простейших.
В зависимости от контекста в настоящей работе будут использованы термины «литические ферменты», «бактериолитические ферменты», «пептидогликангидролазы», «дрожжелитические ферменты», «литические протеазы».
В период 5 Ох - 70х годов 20 века проводилась интенсивная работа по поиску продуцентов таких ферментов, их выделению и изучению свойств. Сейчас известно, что многие живые организмы - от вирусов до человека - продуцируют литические ферменты. Среди бактерий обнаружены продуценты ферментов, активно лизирующих не только клетки бактерий-конкурентов, но и клетки микроорганизмов других систематических групп - дрожжей, мицелиальных грибов, простейших. Для таких бактерий в 1978 году был сформирован порядок Lysobacterales, включающий семейство Lysobacteraceae и род Lysobacter, объединяющий четыре вида (Christensen and Cook, 1978). В эту систематическую группу были переведены бактерии, ранее относившиеся к другим родам, но по ряду свойств, а главное по литической способности, отличающиеся от их типичных представителей. В дальнейшем интерес к лизирующим бактериям несколько ослаб, однако сейчас они вновь стали интересовать исследователей. В период первого десятилетия 21 века выявлено одиннадцать новых видов рода Lysobacter. В результате постоянно ведущейся работы по систематизации известных микроорганизмов было скорректировано и систематическое положение рода Lysobacter. Сейчас он включен в семейство Xanthomonadaceae (Bergey"s Manual of Systematic Bacteriology, 2001). В литературе же до сих пор можно наблюдать очевидную путаницу в систематическом положении описываемых продуцентов литических ферментов. Например, продуцент ферментов, по всем свойствам аналогичных ферментам типового вида рода Lysobacter - Lysobacter enzymogenes - обозначается авторами как Achromobacter lyticus (Shiraki et ah, 2002, Lief or/., 1997).
Для бактерий, продуцирующих внеклеточные литические ферменты, как для
любой бактерии, жизненно необходимы внутриклеточные автолитические ферменты, разрушающие ковалентные связи в пептидогликане - основном структурном компоненте их клеточной стенки, и играющие таким образом главную роль в процессах роста и деления. В клетках бактерий-продуцентов внеклеточных литических ферментов идет параллельный синтез и передвижение через цитоплазматическую мембрану к месту своего действия как автолитических ферментов, которые могут локализоваться в мембране, периплазме и клеточной стенке, так и внеклеточных бактериолитических ферментов, секретируемых в окружающую среду. В связи с этим логичен вопрос о механизме и регуляции процесса одновременного функционирования этих ферментов, о том могут ли автолитические ферменты являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов? К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных выделению и характеристике как внеклеточных, так и внутриклеточных бактериолитических ферментов бактерий. Однако до сих
пор нет сведений по сравнительному изучению у одной и той же бактерии вне- и внутриклеточных литических систем. Автолитические ферменты хорошо изучены у многих представителей грамположительных бактерий (Shockman, Holtje, 1994), у грамотрицательных, за исключением Escherichia coli (Holtje, Tuomanen, 1991), их подробно не изучали.
В 1973 году в ИБФМ АН СССР (ИБФМ РАН) по распоряжению Академии наук была начата работа по теме «Создание эффективных средств борьбы с патогенными множественно устойчивыми к антибиотикам микроорганизмами». Культуральная жидкость грамотрицательной бактерии, выделенной в 1976 году из воды реки Оки в районе очистных сооружений г. Пущино, Московской области, явилась основой препарата, названного лизоамидаза и обладающего бактериолитической и протеолитической активностями. Успешные клинические испытания лизоамидазы позволили зарегистрировать ее в качестве лекарственного средства для лечения наружных инфекций, вызванных грамположительной микрофлорой. По ряду морфологических и биохимических признаков бактерия-продуцент была предположительно отнесена к роду Xanthomonas. Однако по ряду существенных свойств, например, по отсутствию подвижности, продуцент лизоамидазы отличался от бактерий этого рода.
Цель и задачи работы
Цель работы - исследование биохимических и генетических особенностей функционирования и взаимосвязи внутриклеточной и внеклеточной литических систем бактерии-продуцента препарата лизоамидаза для создания на основе полученной информации нового поколения антимикробных лекарственных средств.
Основные задачи:
уточнение таксономического положения бактерии-продуцента;
установление структуры пептидогликана бактерии-продуцента - субстрата автолитических ферментов;
выделение и характеристика внеклеточных литических ферментов бактерии-продуцента;
выделение и характеристика внутриклеточных (автолитических) ферментов продуцента;
установление структуры генов внеклеточных литических ферментов
продуцента;
исследование особенностей взаимодействия литических ферментов с
различными микроорганизмами-мишенями;
получение рекомбинантных литических ферментов продуцента и изучение
их свойств для оценки возможности использования таких ферментов в качестве
основы новых антимикробных препаратов;
изучение возможности использования лизоамидазы и различных форм литических ферментов продуцента для лечения «внутренних» инфекций на примере сибирской язвы.
Научная новизна работы
На основании установленных морфологических, биохимических и генетических свойств бактерия-продуцент антимикробного препарата лизоамидаза отнесена к роду Lysobacter. Исследуемый в настоящей работе штамм Lysobacter sp. XL1 был получен путем селекции из исходной культуры и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ В-2249Д). Установлено, что при длительном выращивании этого литически высокоактивного штамма на средах, способствующих секреции внеклеточных продуктов, в популяции возникают и накапливаются за счет большей скорости роста клетки литически низкоактивного штамма Lysobacter sp. XL2.
Впервые охарактеризованы эндоклеточная и экзоклеточная литические системы одной и той же бактерии на примере Lysobacter sp. XL1 и XL2. В составе эндоклеточной системы обоих штаммов выявлено девять ферментов разной субстратной специфичности и локализации (глюкозидазы, амидазы, эндопептидазы). В составе внеклеточной литической системы Lysobacter sp. XL1 обнаружено пять ферментов, среди которых мурамидаза (ЛЗ), амидаза (Л2), три эндопептидазы (Л1, Л4, Л5). Внеклеточная литическая система низкоактивного штамма Lysobacter sp. XL2 состоит из мурамидазы и амидазы. Свойства ферментов разных литических систем значительно отличаются друг от друга: внутриклеточные ферменты являются кислыми белками, активными при 29С -температуре оптимального роста бактерии, высоком значении ионной силы среды и щелочном значении рН; внеклеточные ферменты - щелочные белки, активные при низких значениях ионной силы, щелочном рН и высоких температурах (50-80С).
Впервые выявлено, что постсекреторное электростатическое взаимодействие высокомолекулярного кислого полисахарида и ферментов Lysobacter sp. XL1 приводит не только к значительной стабилизации ферментов, но и, в ряде случаев, к изменению их активности. Полисахарид усиливает действие мурамидазы на клетки золотистого стафилококка, а литические ферменты, связанные с полисахаридом, становятся способными разрушать покоящиеся споры бактерий рода Bacillus. Полисахарид Lysobacter sp. XL1 полностью ингибирует активность ряда литических ферментов других продуцентов. Очевидно, что образование микроорганизмами таких внеклеточных комплексов является для них экологически значимым.
Впервые показано, что внеклеточные литические ферменты Л2 и Л5 Lysobacter sp. попадают в окружающее клетку пространство внутри образуемых бактерией внешнемембранных везикул. Ферменты, заключенные в везикулы, способны лизировать живые клетки представителей различных групп микроорганизмов, например, грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas, Proteus, Erwinia, Alcaligenes, грамположительных бактерий, относящихся к родам Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Rothayibacter, дрожжей рода Candida, мицелиального гриба Sclerotinia sclerotiorum, в отличие от литических ферментов, находящихся вне везикул. Таким образом, подобный путь секреции литических ферментов имеет для клетки-продуцента важное биологическое значение, так как расширяет спектр микроорганизмов, с которыми она может конкурировать в природе.
Установлены важные особенности взаимодействия внеклеточных литических ферментов Lysobacter sp. с нативными клетками-мишенями. Для эффективного гидролиза клеток грамположительных бактерий ферментам необходим предварительный контакт с отрицательно заряженным полимером клеточной стенки (тейхоевыми или тейхуроновыми кислотами), при этом химическая структура полимера не имеет решающего значения. Нативные клетки грамотрицательных бактерий литические ферменты Lysobacter sp.(3a исключением Л5) разрушают только при условии предварительной дестабилизации внешней мембраны клетки-мишени подходящим способом (температура, полимиксин В, гентамицин, амикацин). Литический фермент Л5 разрушает клетки грамотрицательных бактерий без предварительной обработки.
Практическое значение работы
На основании полученных данных разработан и масштабирован новый регламент получения препарата лизоамидаза с высоким выходом целевого продукта (до 80%).
Разработаны способы получения двух рекомбинантных литических эндопептидаз Lysobacter sp. XLl с использованием гетерологичных систем на основе Е. coli (рефолдинг из телец включения) и Pseudomonas fluorescens (очистка секретируемых белков).
Установлена возможность использования препарата лизоамидаза, а также везикул Lysobacter sp. XLl для лечения различных форм экспериментальной сибирской язвы.
На основе материалов диссертации получены патенты РФ: № 2139348 (1999), № 2193063 (2002), № 2296576 (2007), № 2407782 (2010), № 2408725 (2011), патент USA № 7,150,985 В2 (2006), патент Китая № 274608 (2006), Европейский патент № 1902719 В1 (2011).
Полученные в работе новые данные используются в курсах по биохимии на биологическом факультете МГУ им М.В. Ломоносова и биологических факультетах других высших учебных заведений.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на третьей и четвертой Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами», Кобулети, 1986; Ташкент, 1988; Второй Всесоюзной конференции «Раны и раневая инфекция», Москва, 1986; 14 International Congress of Biochemistry, Prague, CSSR, 1988; Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма», Пущино, 1989; Пятой международной конференции по химии и биотехнологии активных природных соединений, Варна, Болгария, 1989; 1 International symposium «Molecular organization of biological structures», Moscow, 1989; 5 European congress on Biotechnology, Copenhagen, 1990; International conference on antimicrobial activity of nonantibiotices, Copenhagen, 1990; Коференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты», Пущино, 1995; International Conferense «Microbial polysaccharide», Canada, 1995; First International Conference «Polysaccharide Engineering» Trondheim , Норвегия, 1995; Конференции хирургов, Калуга, 1996; IV симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Москва, 1997; Втором съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997;
семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов
«Биотехнологии Подмосковья-97», Пущино, 1997; International symposium «Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology», Pushchino, 2000; международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», Саранск, 2001; 3 Съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002; Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия», Москва, 2002; Втором, Пятом, Шестом московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2003, 2009, 2011; Первом Всероссийском конгрессе «Успехи медицинской микологии», Москва, 2003; III Conference «Biotechnology: State and Perspective of Investigation», Moscow, 2005; Третьей Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2004; Конференции «Фундаментальные науки-медицине», Москва, 2005; конференции «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств», Москва, 2008; Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010», Тула, 2010; Конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2010, Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее», Москва, 2011.
Публикации
Структура и объем работы
Федеральное агентство по образованию
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
Пермский государственный технический университет
Кафедра химии и биотехнологии
Реферат:
Литические ферменты. Лизоцим
Выполнила:
студентка гр.ХТБмПиБ-05
Шевченко И.К.
Руководитель:
к.б.н. Грязнова Д.В.
Пермь, 2010
Литические ферменты микробного происхождения 5
История открытия 5
Локализация и физиологическая роль бактериолитических ферментов в бактериальных культурах 6
Влияние строения клеточных стенок бактерий на литическую способность ферментов 7
Пептидогликан клеточных стенок бактерий. 8
Субстратная специфичность бактериолитических ферментов 9
Открытие бактериолитического комплекса "Лизоамидаза" 10
Перспективы использования лизоамидазы в медицине 10
ЛИЗОЦИМ 12
Механизм лизиса 13
Заключение. 15
Литература. 16
Введение.
Проблема лизиса клеточных стенок микроорганизмов различных таксономических групп с целью повышения их питательной ценности и получения в недеградированном виде биологически активных веществ, содержащихся в протоплазме микробных клеток, является актуальной и имеющей народохозяйственное значение.Для разрушения микробной биомассы известны различные физические и биохимические способы. Ферментативный способ разрушения клеточных стенок, в отличие от физико-химических способов, позволяет осуществлять контролируемое воздействие на клетки и извлекать из них целевые продукты.
Среди ферментов, продуцируемых микроорганизмами, особое место занимают литические ферменты, катализирующие биохимические реакции последовательной деградации структурных элементов микробной клеточной стенки.
Применение препаратов литических ферментов позволяет интенсифицировать выделение из микробной биомассы многих ценных физиологически активных веществ: ферментов, витаминов, аминокислот и др. Известно, что клеточная стенка кормовых дрожжей препятствует усвоению цитоплазматических веществ клетки при скармливании ее животным. Биомасса кормовых дрожжей после ферментативного лизиса клеточных стенок обладает повышенной питательной ценностью, что дает возможность более эффективно использовать её в кормопроизводстве, в том числе в составе заменителей цельного молока для молодняка сельскохозяйственных животных.
Также литические ферменты могут быть использованы в технологиях охраны окружающей среды, на этапах утилизации микробной биомассы, являющейся отходом микробиологических производств.
Кроме того, на основе литических ферментов в последнее время разрабатываются антимикробные лекарственные средства, в том числе для лечения дерматомикозов, которые имеют ряд преимуществ перед химически синтезируемыми фунгицидами. Получены положительные результаты при использовании их для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных. Применение литических ферментов перспективно при борьбе со стафилококковой инфекцией, при лечении кариеса зубов.
Особый интерес для создания промышленного производства ферментов представляют термотолерантные микроорганизмы, в том числе актиномицеты-продуценты литических ферментов, которые обладают высокой скоростью роста и устойчивостью к изменениям температуры культивирования. Также важно, что термотолерантные культуры часто оказываются более конкурентоспособными по сравнению с мезофильными продуцентами в отношении инфицирующей микрофлоры.
Литические ферменты микробного происхождения
Хорошо известно, что клетки бактерий, грибов и высших растений в отличие от клеток животных обладают, как правило, очень мощными клеточными стенками. Это связано с необходимостью противостояния этими организмами многочисленным биологическим, химическим и физическим факторам среды их обитания. Вместе с тем для проведения многих экспериментов в области современной клеточной и молекулярной биологии необходимо иметь "голые", лишенные толстых клеточных стенок клетки этих организмов. Такие "голые" клетки, или "протопласты", широко используют для опытов по слиянию клеток, для различных генноинженерных манипуляций и т.д. В связи с этими проблемами пристальное внимание ученых уже давно привлекают специфические ферменты (биологические катализаторы белковой природы), способные разрушать (лизировать) клеточные стенки бактерий, грибов и высших растений. Кстати говоря, с развитием работ по ферментативному лизису клеточных стенок этих организмов в значительной степени связан достигнутый к настоящему времени прогресс в изучении строения и функционирования поверхностных структур таких клеток.Оказалось, что разрушающие клеточные стенки (литические) ферменты находятся в значительном количестве в самих этих структурах, в непосредственной близости от объектов своего действия. Такие ферменты называются эндогенными (внутриклеточными). Кроме того, установлено, что часть литических ферментов является экзогенными, то есть секретируемыми (выделяемыми) в среду обитания образующих их организмов.
Локализация и физиологическая роль бактериолитических ферментов в бактериальных культурах
Если говорить о месте нахождения бактериолитических ферментов в бактериальной культуре, то следует в первую очередь разделить их в этом отношении на три группы.
Первую группу составляют автолизины - бактериолитические ферменты, присутствующие всегда (в активном или неактивном состоянии) в самой клеточной стенке. Они принимают участие в процессе роста и дифференцировки бактериальных клеток. В клетке бактерий, по-видимому, в норме имеется взаимосвязь между активностями ферментов, разрушающих и синтезирующих компоненты клеточной стенки. Действительно, встраивание вновь синтезированных материалов в клеточную стенку не может происходить без предварительного расщепления определенных химических связей.
Процессы лизиса и биосинтеза стенки происходят одновременно с ростом и развитием бактериальной клетки и только на поздних стадиях развития, когда биосинтетические процессы затихают, а активность литических ферментов остается на прежнем уровне, происходит лизис клетки бактерий.
Ко второй группе можно отнести литические ферменты бактериальных спор . Они активируются наряду с другими ферментами, участвующими в деградации биополимеров в период споруляции (образования спор) и при прорастании спор бактерий. Данные ферменты принимают участие в процессах разрушения оболочки и как автолизины в процессах роста и морфогенеза бактериальной клетки.
Наконец, третья группа - это внеклеточные литические ферменты . Биологическая роль их заключается, по-видимому, в том, что бактерии, синтезирующие и секретирующие такие ферменты в среду, имеют преимущество перед другими бактериями, прежде всего в источниках питания. Разрушая клетки других бактерий, бактерия - продуцент литических ферментов использует аминокислоты, углеводы и другие компоненты лизированной клетки для собственных нужд. Кроме того, данная группа бактериолитических ферментов играет безусловно важную роль для защиты клеток, секретирующих эти ферменты в среду, от других бактерий, обитающих в той же экологической нише.
Влияние строения клеточных стенок бактерий на литическую способность ферментов
Все бактерии можно разделить на две существенно различающиеся группы: грамотрицательную и грамположительную. Различие связано с принципиально разным строением клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий (например, у стафилококков или микрококков) клеточная стенка состоит из многослойной структуры толщиной 70-80 нм, называемой пептидогликаном. Пептидогликановый мешок, покрывающий цитоплазматическую мембрану этих клеток, состоит из полисахаридных цепей, связанных между собой в единую сеть пептидными мостиками. На его долю у грамположительных бактерий приходится до 80% веса их клеточных оболочек. Кроме пептидогликана в состав клеточных стенок этих бактерий входят отрицательно заряженные полимеры - так называемые тейхоевые кислоты (от греч. "тейхос" - стенка). Часть тейхоевых кислот связана ковалентно с пептидогликановой сетью, а часть - с липидами цитоплазматической мембраны. В последнем случае они называются липидтейхоевыми кислотами. Тейхоевые кислоты вследствие присутствия в их составе фосфорной кислоты обеспечивают создание на поверхности клеток грамположительных бактерий электроотрицательного заряда.У одних грамположительных бактерий (например, у золотистого стафилококка) тейхоевые кислоты состоят из нескольких десятков молекул рибитолфосфата - рибитолтейхоевые кислоты, у других грамположительных бактерий эти биополимеры состоят из молекул глицеролфосфата (глицеролтейхоевые кислоты). Тейхоевые кислоты присутствуют только у грамположительных бактерий.
Основным отличием в строении оболочек грамположительных и грамотрицательных бактерий является наличие у последних кроме цитоплазматической еще одной, так называемой внешней мембраны. Данная структура, расположенная над тонким, одно-трехслойным пептидогликановым мешком (8 нм), является типичной двуслойной мембраной, в которой выявлено довольно много достаточно уникальных компонентов: липополисахаридов, липопротеинов, а также белков - поринов, из которых образованы поры во внешней мембране, позволяющие проникать в оболочку (и из нее в среду) сравнительно низкомолекулярным соединениям.
Бактериолитические ферменты не могут гидролизовать пептидогликановый слой в целых клетках грамотрицательных бактерий без удаления внешней мембраны, которое может быть достигнуто только обработкой этих клеток хелатирующими агентами, детергентами или физическими методами.
Пептидогликан клеточных стенок бактерий.
Он ответствен в первую очередь за поддержание формы бактериальных клеток и является структурой, на разрушение которой направлено действие бактериолитических ферментов. Важно при этом подчеркнуть, что у всех истинных бактерий пептидогликан обязательно присутствует, но доступность его для действия бактериолитических ферментов у грамположительных и грамотрицательных существенно отличается.Как уже было указано выше, пептидогликан состоит из полисахаридных цепей и пептидных мостиков, объединяющих всю структуру в единый "мешок", окружающий бактериальную клетку снаружи. Полисахаридные (гликановые) цепи образованы чередованием двух "кирпичей" - азотсодержащих производных глюкозы: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты - и в целом представляют собой хитиноподобную структуру. Это интересно с эволюционной точки зрения, так как хитин и хитиноподобные структуры широко распространены почти у всех представителей живого мира (исключая только растения) и являются одними из наиболее распространенных на Земле биополимеров.
Строение гликановых цепей пептидогликана большинства изученных бактерий одинаково. Пептидная же часть пептидогликана у разных бактерий может существенно отличаться. Однако во всех случаях она образована из 4-5 остатков L- или D-аминокислот. Эти короткие пептиды, с одной стороны, своей свободной NH2-группой соединены амидной связью с карбоксилом мурамовой кислоты, а с другой - связаны с таким же коротким пептидом соседней гликановой цепи. У грамположительных бактерий, в частности у золотистого стафилококка, пептиды, связанные с гликановыми цепями, связываются между собой не непосредственно, а с участием дополнительного пептида, так называемого перекрестно-связывающего мостика. У золотистого стафилококка этот пептидный мостик состоит из пяти молекул простейшей аминокислоты глицина. Наличие в структуре пептидогликана грамположительных бактерий таких мостиков делает ее как бы более плотной, что является одной из важнейших причин удерживания именно этими клетками красителя при окрашивании их по Граму. Гидролиз (расщепление с помощью воды) тех или иных связей в пептидогликане приводит к деградации клеточной стенки и лизису бактерий.
Субстратная специфичность бактериолитических ферментов
По субстратной специфичности бактериолитические ферменты делятся на три типа.
Первый тип составляют так называемые гликозидазы, разрушающие полисахаридные (гликановые) цепи. К ним относятся N-ацетилмурамидаза (лизоцим), гидролизующая связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином, и N-глюкозаминидаза, гидролизующая связь между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой.
Второй тип представлен одним ферментом - N-ацетилмурамил-L-аланиламидазой (или просто амидазой), расщепляющей связь между мурамовой кислотой полисахарида и пептидной частью.
К третьему типу относятся пептидазы, гидролизующие пептидные связи пептидогликана.
Открытие бактериолитического комплекса "Лизоамидаза"
В 1975 году в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН в Пущине (на берегу р.Оки) было сделано интересное наблюдение. В водах Оки ниже Пущина микробиологами Г.К. Скрябиным, В.А. Ламбиной и др. было обнаружено довольно обширное "стерильное пятно", практически не содержащее бактерий. Из проб воды в непосредственной близости от "пятна" была выделена культура бактерий рода Xanthomonas, которые выделяли в среду некий фактор, тормозящий рост многих бактерий, в том числе и патогенных. Биохимики института под моим руководством установили, что действующим антибактериальным началом этого "фактора" является комплекс высокомолекулярного полисахарида, заряженного электроотрицательно, и положительно заряженных ферментов. Очищенный препарат этого комплекса был назван лизоамидазой. Уже на первом этапе его биохимического изучения было установлено, что он содержит бактериолитические ферменты, способные расщеплять в пептидогликане пептидные (или амидные) связи, приводя в конечном итоге к лизису бактериальных клеток.Перспективы использования лизоамидазы в медицине
Уже на первом этапе изучения свойств препарата лизоамидазы стало ясно, что он может успешно использоваться не только в биологии, например для получения лишенных клеточных стенок протопластов бактерий (рис. 4), но и в медицине. Оказалось, что препарат лизоамидаза является эффективным средством борьбы со множественно устойчивыми к антибиотикам патогенными микроорганизмами.В настоящее время одной из важнейших проблем медицины является очень быстрое возникновение у клинических форм патогенных бактерий устойчивости (невосприимчивости) к используемым в медицинской практике антибиотикам. Например, в большинстве родильных домов как в России, так и в других странах по указанным выше причинам становится все труднее бороться с гнойными инфекциями, вызываемыми, в частности, такими бактериями, как стафилококки и стрептококки. Вместе с тем было показано, что препарат лизоамидаза очень эффективно лизирует множественно устойчивые к антибиотикам штаммы стафилококков и других грамположительных патогенных бактерий.
Лизоамидаза эффективно убивает клинические штаммы, на которые ни при каких концентрациях не действуют практически все применяемые в российских клиниках антибиотики. Дальнейшие медико-биологические и клинические испытания этого препарата привели медиков к заключению, что лизоамидаза - прекрасное средство борьбы с гнойными инфекциями. Она может широко использоваться в гнойной хирургии, стоматологии, гинекологии при лечении трудно заживающих трофических язв и т.д. В настоящее время препарат допущен к применению в медицинской практике и его производство налажено на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов медицинского назначения.
При медико-биологическом и клиническом испытании препарата оказалось, что он обладает не только литическим действием на патогенные бактерии, но также хорошо очищает раны от некротических (мертвых) тканей, а также стимулирует заживление ран, обладая мощным иммуностимулирующим действием.
Выяснилось, что эффективная очистка ран от некротических масс (в первую очередь состоящих из денатурированных белков) связана с присутствием в препарате лизоамидазы не только бактериолитических ферментов, но также и протеаз (белокразрушающих ферментов). А иммуностимулирующая активность лизоамидазы обусловлена присутствием в препарате полисахарида. Наличие полисахарида имеет принципиальное значение для возможности использования лизоамидазы в медицине, поскольку имеющиеся в лизоамидазе бактериолитические ферменты связаны электростатически с полисахаридом, что приводит к существенной их стабилизации. После отделения от полисахарида бактериолитические ферменты лизоамидазы, как и другие ранее известные их аналоги, через несколько дней теряют ферментативную активность. В составе же лизоамидазы эти ферменты сохраняют на холоде свою активность практически без изменения в течение нескольких лет, что является обязательным требованием к медицинским препаратам.
ЛИЗОЦИМ
Лизоцим (мурамидаза) - антибактериальный агент, фермент класса гидролаз, разрушающий клеточные оболочки бактерий путём гидролиза мурамилглюкозамина клеточной стенки грам-положительных бактерий. Лизоцим содержится, в первую очередь , в местах соприкосновения организма животных с окружающей средой - в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, слёзной жидкости, грудном молоке, слюне, слизи носоглотки и т. д. В больших количествах лизоцим содержится в слюне, чем объясняются ее антибактериальные свойства. В грудном молоке человека концентрация лизоцима весьма высока (около 400 мг/л). Это намного больше, чем в коровьем. При этом концентрация лизоцима в грудном молоке не снижается со временем, через полгода после рождения ребенка она начинает возрастать.Открыт в 1922г Александром Флемингом в слизи из полости носа и затем обнаружен во многих тканях и жидкостях человеческого организма (хрящи, селезёнка, лейкоциты, слёзы), в растениях (капуста, репа, редька, хрен), в некоторых бактериях и фагах и, в наибольшем количестве, в яичном белке. Лизоцим из разных источников различаются по строению, но близки по действию. Лизоцим яичного белка - первый фермент, для которого методом рентгеноструктурного анализа установлена трёхмерная структура и выявлена связь между строением и механизмом действия (1965); эти исследования - существенный вклад в представления о механизмах ферментативного катализа в целом.
Лизоцим - белок с молекулярной массой около 14 000; единственная полипептидная цепь состоит из 129 аминокислотных остатков и свёрнута в компактную глобулу (30×30×45 Å). Трёхмерная конформация полипептидной цепи поддерживается 4 дисульфидными (- S - S -) связями. (В лизоциме молока человека их 3, яичного белка гуся - 2, в лизоциме фага Т4 их нет; чем больше дисульфидных групп, тем лизоцим более устойчив, но менее активен.) Глобула лизоцима состоит из двух частей , разделённых щелью; в одной части большинство аминокислот (лейцин, изолейцин, триптофан и др.) содержит гидрофобные группы, в др. преобладают аминокислоты (лизин, аргинин, аспарагиновая к-та и др.) с полярными группами. Полярность окружения влияет на ионизацию двух карбоксильных групп (- СООН), расположенных на поверхности щели молекулы с разных её сторон (см. рис.). Лизоцим действует на один из основных компонентов бактериальной стенки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров. Полисахарид сорбируется на молекуле лизоцима в щели на границе гидрофобной и гидрофильной её частей таким образом, что с ферментом связывается 6 колец аминосахаров, а одна из соединяющих их гликозидных связей (между 4 и 5 кольцами) оказывается между карбоксилами. Благодаря взаимодействиям между карбоксилами лизоцимf и атомами, образующими гликозидную связь, а также искажению валентных углов субстрата, происходит активация и разрыв связи. Это ведёт к разрушению оболочки бактериальной клетки.
Рис. Строение лизоцима. (Н. А. Кравченко)
Механизм лизиса
Фермент атакует пептидогликаны (в частности, муреин), входящие в состав клеточных стенок бактерий (особенно грам-положительных). Лизоцим гидролизует (1,4)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином. Пептидогликан при этом связывается с активным центром фермента (в форме кармана), расположенным между двумя его структурными доменами. Молекула субстрата в активном центре принимает конформацию, близкую к конформации переходного состояния. В соответствии с механизмом Филлипса, лизоцим связывается с гексасахаридом, затем переводит 4-й остаток в цепи в конформацию твист-кресла. В этом напряженном состоянии гликозидная связь легко разрушается.Остатки глутаминовой кислоты (Glu35) и аспарагиновой кислоты (Asp52) критичны для функционирования фермента. Glu35 выступает в качестве донора протона при разрыве гликозидной связи субстрата, разрушая связь, а Asp52 выступает в роли нуклеофила, при образовании интермедиата - гликозил-фермента. Затем гликозил-фермент реагирует с молекулой воды, в результате чего фермент возвращается в исходное состояние и образуется продукт гидролиза.
Применение
Препарат лизоцим применяют при лечении глаз, носоглотки, дёсен, ожогах, в акушерстве и др . В пищевой промышленности зарегистрирован в качестве пищевой добавки E1105.
Заключение.
Приведенные данные, свидетельствуют о важной роли, которую играют бактериолитические ферменты в жизнедеятельности бактерий и бактериальных сообществ, находящихся в одной и той же экологической нише.На примере препарата лизоамидаза и лизоцими продемонстрированы перспективы использования бактериолитических ферментов в качестве эффективного лечебного средства для борьбы с патогенными бактериями, в том числе и множественно устойчивыми к антибиотикам.
Несмотря на большой интерес, проявляемый к проблеме ферментативного лизиса микроорганизмов, промышленное производство препаратов литических ферментов в России отсутствует . Поэтому изучение условий биосинтеза литических ферментов и разработка технологии получения ферментного препарата литического действия для использования в различных отраслях народного хозяйства и медицине, является актуальной и перспективной.
Литература.
1. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Г.В. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине // Вестн. АМН СССР. 1984. № 8. С. 64-69.2. Савельев Е.П., Петров Г.И. Молекулярные основы строения клеточной стенки бактерий // Успехи биол.химии. 1978. Т. 19. С. 106.
3. Захарова И.Я., Павлова И.Н. Литические ферменты микроорганизмов. Киев: Наук. думка, 1985.
4. Скрябин Г.К., Кулаев И.С. Лизоамидаза - вызов микробам // Наука в СССР. 1990. № 2. С. 52-53.
5. Кулаев И.С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине. // СОЖ, 1997, № 3, с. 23–31.
6. Филлипс Д., Трехмерная структура молекулы фермента, в сборнике: Молекулы и клетки, пер. с англ., в. 3, М., 1968;
7. Википедия: свободная энциклопедия [Электронный ресурс]. – URL: http://ru.wikipedia.org/wiki/Лизоцим (дата обращения: 15.05.2010)
8. Академика: электронные энциклопедии [Электронный ресурс]. – URL: http://dic.academic.ru/dic.nsf/bse/103560/лизоцим (дата обращения: 15.05.2010)
В клетке любого живого организма протекают миллионы химических реакций. Каждая из них имеет большое значение, поэтому важно поддерживать скорость биологических процессов на высоком уровне. Почти каждая реакция катализируется своим ферментом. Что такое ферменты? Какова их роль в клетке?
Ферменты. Определение
Термин "фермент" происходит от латинского fermentum - закваска. Также они могут называться энзимами от греческого en zyme - "в дрожжах".
Ферменты - биологически активные вещества, поэтому любая реакция, протекающая в клетке, не обходится без их участия. Эти вещества выполняют роль катализаторов. Соответственно, любой фермент обладает двумя основными свойствами:
1) Энзим ускоряет биохимическую реакцию, но при этом не расходуется.
2) Величина константы равновесия не меняется, а лишь ускоряется достижение этого значения.
Ферменты ускоряют биохимические реакции в тысячу, а в некоторых случаях в миллион раз. Это значит, что при отсутствии ферментативного аппарата все внутриклеточные процессы практически остановятся, а сама клетка погибнет. Поэтому роль ферментов как биологически активных веществ велика.
Разнообразие энзимов позволяет разносторонне регулировать метаболизм клетки. В любом каскаде реакций принимает участие множество ферментов различных классов. Биологические катализаторы обладают большой избирательностью благодаря определенной конформации молекулы. Т. к. энзимы в большинстве случаев имеют белковую природу, они находятся в третичной или четвертичной структуре. Объясняется это опять же специфичностью молекулы.
Функции энзимов в клетке
Главная задача фермента - ускорение соответствующей реакции. Любой каскад процессов, начиная с разложения пероксида водорода и заканчивая гликолизом, требует присутствия биологического катализатора.
Правильная работа ферментов достигается высокой специфичностью к определенному субстрату. Это значит, что катализатор может ускорять только определенную реакцию и никакую больше, даже очень похожую. По степени специфичности выделяют следующие группы энзимов:
1) Ферменты с абсолютной специфичностью, когда катализируется только одна-единственная реакция. Например, коллагеназа расщепляет коллаген, а мальтаза расщепляет мальтозу.
2) Ферменты с относительной специфичностью. Сюда входят такие вещества, которые могут катализировать определенный класс реакций, к примеру, гидролитическое расщепление.
Работа биокатализатора начинается с момента присоединения его активного центра к субстрату. При этом говорят о комплементарном взаимодействии наподобие замка и ключа. Здесь имеется в виду полное совпадение формы активного центра с субстратом, что дает возможность ускорять реакцию.
Следующий этап заключается в протекании самой реакции. Ее скорость возрастает благодаря действию ферментативного комплекса. В конечном итоге мы получаем энзим, который связан с продуктами реакции.
Заключительный этап - отсоединение продуктов реакции от фермента, после чего активный центр вновь становится свободным для очередной работы.
Схематично работу фермента на каждом этапе можно записать так:
1) S + E ——> SE
2) SE ——> SP
3) SP ——> S + P , где S - это субстрат, E - фермент, а P - продукт.
Классификация ферментов
В организме человека можно найти огромное количество ферментов. Все знания об их функциях и работе были систематизированы, и в итоге появилась единая классификация, благодаря которой можно легко определить, для чего предназначен тот или иной катализатор. Здесь представлены 6 основных классов энзимов, а также примеры некоторых подгрупп.
- Оксидоредуктазы.
Ферменты этого класса катализируют окислительно-восстановительные реакции. Всего выделяют 17 подгрупп. Оксидоредуктазы обычно имеют небелковую часть, представленную витамином или гемом.
Среди оксидоредуктаз часто встречаются следующие подгруппы:
а) Дегидрогеназы. Биохимия ферментов-дегидрогеназ заключается в отщеплении атомов водорода и переносе их на другой субстрат. Эта подгруппа чаще всего встречается в реакциях дыхания, фотосинтеза. В составе дегидрогеназ обязательно присутствует кофермент в виде НАД/НАДФ или флавопротеидов ФАД/ФМН. Нередко встречаются ионы металлов. Примерами могут служить такие энзимы, как цитохромредуктазы, пируватдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, а также многие ферменты печени (лактатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа и т. д.).
б) Оксидазы. Ряд ферментов катализирует присоединение кислорода к водороду, в результате чего продуктами реакции могут быть вода или пероксид водорода (H 2 0, H 2 0 2). Примеры ферментов: цитохромоксидаза, тирозиназа.
в) Пероксидазы и каталазы - энзимы, катализирующие распад H 2 O 2 на кислород и воду.
г) Оксигеназы. Эти биокатализаторы ускоряют присоединение кислорода к субстрату. Дофамингидроксилаза - один из примеров таких энзимов.
2. Трансферазы.
Задача ферментов этой группы состоит в переносе радикалов от вещества-донора к веществу-реципиенту.
а) Метилтрансферазы. ДНК-метилтрансферазы - основные ферменты, контролирующие процесс репликации нуклеотидов играет большую роль в регуляции работы нуклеиновой кислоты.
б) Ацилтрансферазы. Энзимы этой подгруппы транспортируют ацильную группу с одной молекулы на другую. Примеры ацилтрансфераз: лецитинхолестеринацилтрансфераза (переносит функциональную группу с жирной кислоты на холестерин), лизофосфатидилхолинацилтрансфераза (ацильная группа переносится на лизофосфатидилхолин).
в) Аминотрансферазы - ферменты, которые участвуют в превращении аминокислот. Примеры ферментов: аланинаминотрансфераза, которая катализирует синтез аланина из пирувата и глутамата путем переноса аминогруппы.
г) Фосфотрансферазы. Ферменты этой подгруппы катализируют присоединение фосфатной группы. Другое название фосфотрансфераз, киназы, встречается намного чаще. Примерами могут служить такие энзимы, как гексокиназы и аспартаткиназы, которые присоединяют фосфорные остатки к гексозам (чаще всего к глюкозе) и к аспарагиновой кислоте соответственно.
3. Гидролазы - класс энзимов, которые катализируют расщепление связей в молекуле с последующим присоединением воды. Вещества, которые относятся к этой группе, - основные ферменты пищеварения.
а) Эстеразы - разрывают эфирные связи. Пример - липазы, которые расщепляют жиры.
б) Гликозидазы. Биохимия ферментов этого ряда заключается в разрушении гликозидных связей полимеров (полисахаридов и олигосахаридов). Примеры: амилаза, сахараза, мальтаза.
в) Пептидазы - энзимы, катализирующие разрушение белков до аминокислот. К пептидазам относятся такие ферменты, как пепсины, трипсин, химотрипсин, карбоиксипептидаза.
г) Амидазы - расщепляют амидные связи. Примеры: аргиназа, уреаза, глутаминаза и т. д. Многие ферменты-амидазы встречаются в
4. Лиазы - ферменты, по функции схожие с гидролазами, однако при расщеплении связей в молекулах не затрачивается вода. Энзимы этого класса всегда имеют в составе небелковую часть, например, в виде витаминов В1 или В6.
а) Декарбоксилазы. Эти ферменты действуют на С-С связь. Примерами могут служить глутаматдекарбоксилаза или пируватдекарбоксилаза.
б) Гидратазы и дегидратазы - ферменты, которые катализируют реакцию расщепления связей С-О.
в) Амидин-лиазы - разрушают С-N связи. Пример: аргининсукцинатлиаза.
г) Р-О лиазы. Такие ферменты, как правило, отщепляют фосфатную группу от вещества-субстрата. Пример: аденилатциклаза.
Биохимия ферментов основана на их строении
Способности каждого энзима определяются индивидуальным, только ему свойственным строением. Любой фермент - это, прежде всего, белок, и его структура и степень сворачивания играют решающую роль в определении его функции.
Для каждого биокатализатора характерно наличие активного центра, который, в свою очередь, делится на несколько самостоятельных функциональных областей:
1) Каталитический центр - это специальная область белка, по которой происходит присоединение фермента к субстрату. В зависимости от конформации белковой молекулы каталитический центр может принимать разнообразную форму, которая должна соответствовать субстрату так же, как замок ключу. Такая сложная структура объясняет то, что находится в третичном или четвертичном состоянии.
2) Адсорбционный центр - выполняет роль «держателя». Здесь в первую очередь происходит связь между молекулой фермента и молекулой-субстратом. Однако связи, которые образует адсорбционный центр, очень слабые, а значит, каталитическая реакция на этом этапе обратима.
3) Аллостерические центры могут располагаться как в активном центре, так и по всей поверхности фермента в целом. Их функция - регулирование работы энзима. Регулирование происходит с помощью молекул-ингибиторов и молекул-активаторов.
Активаторные белки, связываясь с молекулой фермента, ускоряют его работу. Ингибиторы же, напротив, затормаживают каталитическую активность, причем это может происходить двумя способами: либо молекула связывается с аллостерическим центром в области активного центра фермента (конкурентное ингибирование), либо она присоединяется к другой области белка (неконкурентное ингибирование). считается более действенным. Ведь при этом закрывается место для связывания субстрата с ферментом, причем этот процесс возможен только в случае практически полного совпадения формы молекулы ингибитора и активного центра.
Энзим зачастую состоит не только из аминокислот, но и из других органических и неорганических веществ. Соответственно, выделяют апофермент - белковую часть, кофермент - органическую часть, и кофактор - неорганическую часть. Кофермент может быть представлен улгеводами, жирами, нуклеиновыми кислотами, витаминами. В свою очередь, кофактор - это чаще всего вспомогательные ионы металлов. Активность ферментов определяется его строением: дополнительные вещества, входящие в состав, меняют каталитические свойства. Разнообразные виды ферментов - это результат комбинирования всех перечисленных факторов образования комплекса.
Регуляция работы ферментов
Энзимы как биологически активные вещества не всегда необходимы организму. Биохимия ферментов такова, что они могут в случае чрезмерного катализа навредить живой клетке. Для предотвращения пагубного влияния энзимов на организм необходимо каким-то образом регулировать их работу.
Т. к. ферменты имеют белковую природу, они легко разрушаются при высоких температурах. Процесс денатурации обратим, однако он может существенно повлиять на работу веществ.
pH также играет большую роль в регуляции. Наибольшая активность ферментов, как правило, наблюдается при нейтральных значениях pH (7,0-7,2). Также есть энзимы, которые работают только в кислой среде или только в щелочной. Так, в клеточных лизосомах поддерживается низкий pH, при котором активность гидролитических ферментов максимальна. В случае их случайного попадания в цитоплазму, где среда уже ближе к нейтральной, их активность снизится. Такая защита от «самопоедания» основана на особенностях работы гидролаз.
Стоит упомянуть о значении кофермента и кофактора в составе ферментов. Наличие витаминов или ионов металла существенно влияет на функционирование некоторых специфических энзимов.
Номенклатура ферментов
Все ферменты организма принято называть в зависимости от их принадлежности к какому-либо из классов, а также по субстрату, с которым они вступают в реакцию. Иногда по используют в названии не один, а два субстрата.
Примеры названия некоторых энзимов:
- Ферменты печени: лактат-дегидроген-аза, глутамат-дегидроген-аза.
- Полное систематическое название фермента: лактат-НАД+-оксидоредукт-аза.
Сохранились и тривиальные названия, которые не придерживаются правил номенклатуры. Примерами являются пищеварительные ферменты: трипсин, химотрипсин, пепсин.
Процесс синтеза ферментов
Функции ферментов определяются еще на генетическом уровне. Т. к. молекула по большому счету - белок, то и ее синтез в точности повторяет процессы транскрипции и трансляции.
Синтез ферментов происходит по следующей схеме. Вначале с ДНК считывается информация о нужном энзиме, в результате чего образуется мРНК. Матричная РНК кодирует все аминокислоты, которые входят в состав энзима. Регуляция ферментов может происходить и на уровне ДНК: если продукта катализируемой реакции достаточно, транскрипция гена прекращается и наоборот, если возникла потребность в продукте, активизируется процесс транскрипции.
После того как мРНК вышла в цитоплазму клетки, начинается следующий этап - трансляция. На рибосомах эндоплазматической сети синтезируется первичная цепочка, состоящая из аминокислот, соединенных пептидными связями. Однако молекула белка в первичной структуре еще не может выполнять свои ферментативные функции.
Активность ферментов зависит от структуры белка. На той же ЭПС происходит скручивание протеина, в результате чего образуются сначала вторичная, а потом третичная структуры. Синтез некоторых ферментов останавливается уже на этом этапе, однако для активизации каталитической активности зачастую необходимо присоединение кофермента и кофактора.
В определенных областях эндоплазматической сети происходит присоединение органических составляющих энзима: моносахаридов, нуклеиновых кислот, жиров, витаминов. Некоторые ферменты не могут работать без наличия кофермента.
Кофактор играет решающую роль в образовании Некоторые функции ферментов доступны только при достижении белком доменной организации. Поэтому для них очень важно наличие четвертичной структуры, в которой соединяющим звеном между несколькими глобулами белка является ион металла.
Множественные формы ферментов
Встречаются ситуации, когда необходимо наличие нескольких энзимов, катализирующих одну и ту же реакцию, но отличающихся друг от друга по каким-либо параметрам. Например, фермент может работать при 20 градусах, однако при 0 градусов он уже не сможет выполнять свои функции. Что делать в подобной ситуации живому организму при низких температурах среды?
Эта проблема легко решается наличием сразу нескольких ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но работающих в разных условиях. Существуют два типа множественных форм энзимов:
- Изоферменты. Такие белки кодируются разными генами, состоят из разных аминокислот, однако катализируют одну и ту же реакцию.
- Истинные множественные формы. Эти белки транскрибируются с одного и того же гена, однако на рибосомах происходит модификация пептидов. На выходе получают несколько форм одного и того же фермента.
В результате первый тип множественных форм сформирован на генетическом уровне, когда второй - на посттрансляционном.
Значение ферментов
В медицине сводится к выпуску новых лекарственных средств, в составе которых вещества уже находятся в нужных количествах. Ученые еще не нашли способ стимулирования синтеза недостающих энзимов в организме, однако сегодня широко распространены препараты, которые могут на время восполнить их недостаток.
Различные ферменты в клетке катализируют большое количество реакций, связанных с поддержанием жизнедеятельности. Одними из таких энизмов являются представители группы нуклеаз: эндонуклеазы и экзонуклеазы. Их работа заключается в поддержании постоянного уровня нуклеиновых кислот в клетке, удалении поврежденных ДНК и РНК.
Не стоит забывать о таком явлении, как свертывание крови. Являясь эффективной мерой защиты, данный процесс находится под контролем ряда ферментов. Главным из них является тромбин, который переводит неактивный белок фибриноген в активный фибрин. Его нити создают своеобразную сеть, которая закупоривает место повреждения сосуда, тем самым препятствуя излишней кровопотере.
Ферменты используются в виноделии, пивоварении, получении многих кисломолочных продуктов. Для получения спирта из глюкозы могут использоваться дрожжи, однако для удачного протекания этого процесса достаточно и экстракта из них.
Интересные факты, о которых вы не знали
Все ферменты организма имеют огромную массу - от 5000 до 1000000 Да. Это связано с наличием белка в составе молекулы. Для сравнения: молекулярная масса глюкозы - 180 Да, а углекислого газа - всего 44 Да.
На сегодняшний день открыто более чем 2000 ферментов, которые были обнаружены в клетках различных организмов. Однако большинство из этих веществ до конца еще не изучено.
Активность ферментов используется для получения эффективных стиральных порошков. Здесь энзимы выполняют ту же роль, что и в организме: они разрушают органические вещества, и это свойство помогает в борьбе с пятнами. Рекомендуется использовать подобный стиральный порошок при температуре не выше 50 градусов, иначе может пойти процесс денатурации.
По статистике, 20% людей по всему миру страдает от недостатка какого-либо из ферментов.
О свойствах энзимов знали очень давно, однако только в 1897 году люди поняли, что для сбраживания сахара в спирт можно использовать не сами дрожжи, а экстракт из их клеток.
Механизм д-я: основной компонент стенок бактерий – пептидогликан – субстрат для литических ферментов лизис оболочки микроорганизмов
· Лизосубтилин
· Формосорб
· Лизоцим
· Пепсинорм
Показания:
профилактика и лечение диарейных заболеваний телят (все)
хронические септические состояния, ожоги, обморожения, конъюнктивиты, афтозные стоматиты и др. инфекционные заболевания (Лизоцим).
Протеолитические ферменты.
Механизм д-я: лизируют белки и продукты их распада в некротизированных тканях (на здоровые ткани не действуют)
· Трипсин
· Химотрипсин
· Химопсин
· Террилитин
· Рибонуклеаза + деполимеризует РНК – задерживает развитие РНК содержащих вирусов
· Дезоксирибонуклеаза + гидрализует ДНК – задерживает развитие аденовирусов, вирусов герпеса
· Коллагеназа - действует преимущественно на коллагеновые волокна
· Элластолитин – обладает протеолитическим и муколитическим действием
Показания: гнойно-некротические процессы (бронхопневмонии, плевриты, ожоги, гнойные раны, ириты, иридоциклиты, конъюнктивиты и т.д.)
Фибринолитические ферменты.
· Фибринолизин
· Стрептолиаза
· Урокиназа
· Альтеплаза и др.
Разные ферментные препараты
| Ø Лидаза Ø Ронидаза | Содержат гиалуронидазу→ распад гиалуроновой к-ты → проницаемость тканей Применяют: местно при гематомах, артрозах, артритах, тендовагинитах, для всасывания лек. ве-в, вводимых п/к |
| Ø Цитохром С | Обеспечивает процессы тканевого дыхания Применяют: при сниженном тканевом дыхании (асфиксия новорожденных, хроническая пневмония, сердечная недостаточность, инфекционный гепатит, интоксикации и т.д.) |
| Ø Пенициллиназа | Инактивирует бензилпенициллин Применяют: при аллергических реакциях на пенициллины |
Коферментные препараты
· Кокарбоксилаза
· Рибофлавина мононуклеотид
· Флавинат
· Пиридоксальфосфат
· Кобамамид и др.
Ингибиторы ферментов
· Ингибиторы протеолитических ферментов
Апротинин (контрикал, трасилол, ингитрил,гордокс)
· Избирательные ингибиторы фибринолиза
Аминокапроновая к-та, Транексамовая к-та
· Антихолинэстеразные пре-ты
Прозерин, галантамин, физостигмин
· Ингибиторы МАО
Ниаламид, Моклобемид, Селегилин
· Ингибиторы карбоангидразы
Ацетазоламид (диакарб)
· Ингибитры ангиотензинпревращающего фермента
Каптоприл, эналаприл, лизиноприл и др.
· Ингибиторы ксантиноксидазы
Аллопуринол
· Ингибиторы ацетальдегидрогеназы
Реактиваторы ферментов
Реактиваторы холинэстеразы:
Тримедоксим (дипироксим)
Аллоксим в\м
Изонитрозин в\м
Пралидоксима хлорид
Ферментные препараты
1. Ферментные препараты микробного синтеза
2. Ферментные препараты животного происхождения
Литические ферменты
Протеолитические ферменты
Фибринолитичекие препараты (фибринолизин, стрептолиаза,альтеплаза и др.)
Разные ферментные препараты
Коферментные препараты
кокарбоксилаза, рибофлавина мононуклеотид, флавинат, пиридоксальфосфат, кобамамид и др.
Ингибиторы ферментов
Ингибиторы протеолитических ферментов
Избирательные ингибиторы фибринолиза
Антихолинэстеразные пре-ты
Ингибиторы МАО
Реактиваторы ферментов
Ферментные препараты
Стимулирующие процессы пищеварения
