Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF Ефимов Григорий Александрович. Методы генной инженерии при получении рекомбинантных белков Генно инженерные белки
Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А.А.). По Э.С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.
Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.
Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний .
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
Быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
Конструирование рекомбинантной ДНК;
Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
Клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов – прежде всего ферментов рестрикции. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы .
Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. Однако одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК.
Одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК.
Естественный отбор - движущая сила эволюции
Естественный отбор - это процесс, направленный на предпочтительное выживание более приспособленных и уничтожение менее приспособленных организмов. Более приспособленные особи имеют возможность оставить потомство. Материалом для отбора слу...
Выявление возбудителей брожения пектиновых веществ
Постановка опыта.
Снопик льняной соломы высотой 6-7 см перевязывают в двух местах ниткой и вносят в пробирку лучше большего, чем стандартный, размера, наполненную на 2/3 водопроводной водой. Пробирку зажимают пинцетом и кипятят на горелк...
Переход от биосферы к ноосфере
Превращение разума и труда человечества в геологическую силу планетного масштаба происходило в рамках биосферы, составной частью которой они являются. В.И. Вернадский в своих исследованиях неизменно подчёркивал, какое огромное воздействие...
Белковая инженерия (англ. Protein engineering) -- раздел биотехнологии, который занимается разработкой полезных или ценных белков. Это относительно новая дисциплина, которая направлена на исследование фолдинга белков и принципов модификации и создания белков.
Существуют две основные стратегии для белковой инженерии: направленная модификация белка и направленная эволюция. Эти методы не являются взаимоисключающими; исследователи часто применяют оба. В будущем, более детальное знание структуры и функции белков, а также достижения в области высоких технологий, может значительно расширить возможности белковой инженерии. В итоге, даже неприродные аминокислоты могут быть включены благодаря новому методу, который позволяет включать новые аминокислоты в генетический код .
Белковая инженерия зародилась на стыке физики и химии белка и генетической инженерии. Она решает задачу создания модифицированных или гибридных молекул белков с заданными характеристиками. Естественным путем реализации такой задачи является предсказание структуры гена, кодирующего измененный белок, осуществление его синтеза, клонирования и экспрессии в реципиентных клетках .
Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы -- субтилизина они применили метод химической модификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность.
Белок в химическом отношении представляет собой однотипную молекулу, которая является полиаминокислотной цепочкой или полимером. Составлен он из аминокислотных последовательностей 20 типов. Узнав строение белков, люди задались вопросом: можно ли спроектировать абсолютно новые аминокислотные последовательности, чтобы они выполняли нужные человеку функции гораздо лучше, чем обычные белки? Для данной идеи подошло название Белковая инженерия .
О такой инженерии стали задумываться ещё в 50-е годы XX столетия. Случилось это сразу же после расшифровки первых белковых аминокислотных последовательностей. Во многих лабораториях мира начали делать попытки дублировать природу и синтезировать химическим путём заданные абсолютно произвольно полиаминокислотные последовательности.
Больше всех в этом преуспел химик Б. Меррифилд. Этому американцу удалось разработать чрезвычайно эффективный метод синтеза полиаминокислотных цепей. За это Меррифилду в 1984 году присудили Нобелевскую премию по химии.
Рисунок 1. Схема функционирования белковой инженерии
Американец начал синтезировать короткие пептиды, включая гормоны. При этом построил автомат - «химического робота» - в задачу которого входило производит искусственные белки. Робот вызвал сенсацию в научных кругах. Однако скоро выяснилось, что его продукция не может конкурировать с тем, что производит природа.
Робот не мог в точности воспроизводить аминокислотные последовательности, то есть ошибался. Он синтезировал одну цепь с одной последовательностью, а другую уже с немного изменённой. В клетке же все молекулы одного белка идеально похожи друг на друга, то есть их последовательности абсолютно одинаковые.
Была и другая проблема. Даже те молекулы, которые робот синтезировал правильно, не принимали ту пространственную форму, которая необходима для функционирования фермента. Таким образом, попытка подменить природу обычными методами органической химии привела к весьма скромному успеху.
Учёным оставалось учиться у природы, выискивая нужные модификации белков. Тут дело в том, что в природе постоянно идут мутации, ведущие к изменению аминокислотных последовательностей белков. Если отобрать мутантов с необходимыми свойствами, более эффективно перерабатывающих тот или иной субстрат, то можно выделить из такого мутанта измененный фермент, благодаря которому клетка приобретает новые свойства. Но данный процесс занимает очень большой период времени.
Все изменилось тогда, когда появилась генная инженерия. Благодаря ей, стали создавать искусственные гены с любой последовательностью нуклеотидов. Эти гены встраивали в приготовленные молекулы-векторы и внедряли эти ДНК в бактерии или дрожжи. Там с искусственного гена снималась копия РНК. В результате этого вырабатывался нужный белок. Ошибки в его синтезе исключались. Главное, надо было подобрать нужную последовательность ДНК, а дальше уже ферментная система клетки сама безупречно делала своё дело. Таким образом, можно заключить, что генная инженерия открыла путь белковой инженерии в самой радикальной форме .
Стратегии белковой инженерии
Направленная модификация белка. При направленной модификации белка ученый использует детальное знание структуры и функции белка, чтобы внести нужные изменения. Как правило, этот метод имеет то преимущество, что он недорогой и технически несложный, так как техника сайт-направленного мутагенеза хорошо развита. Однако, его основным недостатком является то, что сведения о подробной структуре белка часто отсутствуют, и даже когда структура известна, может быть очень трудно предсказать влияние различных мутаций.
Программные алгоритмы модификации белка стремятся к выявлению новых аминокислотных последовательностей, которые требуют мало энергии для формирования предопределенной целевой структуры. В то время как последовательность, которая должно быть найдена, велика, наиболее сложным требованием для модификации белка является быстрый, но точный, способ для выявления и определения оптимальной последовательности, в отличие ее от аналогичных субоптимальных последовательностей .
Направленная эволюция. В направленной эволюции случайный мутагенез применяется к белку и селекция идет так, чтобы выбрать варианты, которые имеют определенные качества. Далее применяются еще раунды мутации и селекции. Этот метод имитирует естественную эволюцию и в целом позволяет получить превосходные результаты для направленной модификации.
Дополнительный метод, известный как ДНК-перетасовки, смешивает и выявляет части удачных вариантов для получения лучших результатов. Этот процесс имитирует рекомбинации, которые происходят естественно во время полового размножения. Преимуществом направленной эволюции является то, что она не требует предварительных знаний о структуре белка, да и не нужно, чтобы иметь возможность прогнозировать, какое влияние данная мутация будет иметь. В самом деле, результаты экспериментов направленной эволюции удивляют, поскольку желаемые изменения часто бывают вызваны мутациями, которые не должны были иметь такой эффект. Недостатком является то, что этот метод требует высокой пропускной способности, который не представляется возможным для всех белков. Большое количество рекомбинантной ДНК должно быть мутированным и необходимо провести скрининг продуктов на выявление желаемого качества. Огромное количество вариантов часто требует покупки робототехники для автоматизации процесса. Кроме того, не всегда легко провести скрининг на выявление всех интересующих качеств .
В рассмотренных выше библиотеках пептидов последние ковалентно связаны с белком-носителем. В таком виде они являются одними из представителей гибридных белков, получаемых методами генной инженерии.
В другом случае гибридные белки применяют для получения высокого уровня экспрессии коротких пептидов в бактериальных клетках благодаря стабилизации этих пептидов в составе гибридных белков. Часто гибридные белки используют для идентификации и очистки трудноопределяемых рекомбинантных белков. Например, присоединив к С-концу исследуемого белка в качестве белка-репортера -галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности -галактозидазы, определяя ее антигенные детерминанты иммунохимическими методами. Соединяя фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, можно очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Полученные антитела далее применяют для очистки нативного белка, в состав которого входит рекомбинантный полипептид, кодируемый ОРС, и тем самым идентифицируют клонированный фрагмент гена.
С помощью гибридных белков решают и обратную задачу клонирования неизвестного гена, к белковому продукту которого имеются антитела. В таком случае конструируют клонотеку последовательностей нуклеотидов, представляющих ОРС неизвестных генов, в векторах, которые позволяют соединять клонируемую ОРС в одной рамке считывания с геном-репортером. Образующиеся в результате экспрессии этих рекомбинантных генов гибридные белки идентифицируются с помощью антител иммуноферментными методами. Гибридные гены, объединяющие секретируемые белки и белки-репортеры, дают возможность по-новому исследовать механизмы секреции, а также локализацию и перемещение в тканях секретируемых белков.
Гибридные токсины
Серия работ И. Пастана с сотрудниками по конструированию гибридных токсинов направленного действия прекрасно иллюстрирует возможности белковой инженерии в части комбинирования различных функциональных доменов белков для достижения конкретных биологических эффектов.
Рис. II.22. Лекарственные препараты направленного действия на основе гибридных токсинов
а – обобщенная схема структуры лекарственного препарата направленного действия;б – строение псевдомонадного токсина (цифрами обозначено положение аминокислотных остатков);в – строение гибридного токсина;г – гибридный токсин на основе моноклональных антител
Идеальное лекарственное средство строго специфического избирательного действия должно обладать, по крайней мере, следующими структурно-функциональными особенностями (рис. II.22,а ). Такой лекарственный препарат должен заключать в себе действующее начало для достижения физиологического эффекта и лиганд, распознающий рецептор на поверхности клеток-мишеней. Кроме того, в нем должны быть структурные элементы, распознаваемые системой транспорта организма, для доставки лекарства к клеткам-мишеням, а также спейсерный участок, необходимый для отделения действующего начала от остальных функциональных частей препарата после его доставки по адресу. Именно такая идеальная схема реализуется в природном экзотоксине Pseudomonas aeruginosa. Экзотоксин А P. aeruginosa представляет собой белок, состоящий из одной полипептидной цепи длиной в 613 аминокислот, которая организована в три функциональных домена (см. рис. II.22,б ). N-Концевой домен Ia (аминокислотные остатки 1–252) необходим для взаимодействия с поверхностью клеток-мишеней (прототип лиганда идеального лекарства направленного действия). Функции домена Ib (аминокислотные остатки 365–404) в настоящее время неизвестны. Домен II (аминокислотные остатки 253–364) обеспечивает эффективный перенос токсина в цитозоль клеток (система транспорта лекарства), а домен III (аминокислотные остатки 405–613) осуществляет ADP-рибозилирование фактора элонгации трансляции EF2, что приводит к подавлению трансляции и гибели клеток-мишеней. Таким образом, для оказания цитотоксического действия экзотоксину A необходимо с помощью домена Iа распознать рецепторы на поверхности клеток, проникнуть в клетку с помощью эндоцитоза, опосредованного рецепторами, и быть транслоцированным через внутреннюю мембрану в цитозоль, где локализуется фактор EF2. Основная идея в создании токсинов направленного действия заключалась в том, чтобы заменить домен Iа на какой-либо иной пептидный лиганд, взаимодействующий с другой группой рецепторов на поверхности клеток, и тем самым изменить специфичность действия токсина в отношении самих клеток (см. рис. II.22,в ).
Было установлено, что удаление домена Iа генно-инженерными методами резко (в сотни и тысячи раз) снижает токсичность такого укороченного белка как в отношении клеток различных линий, так и in vivo. Присоединение к С-концевой части укороченного полипептида молекулы интерлейкина 2 человека осуществляли путем объединения структурных частей соответствующих генов в экспрессирующем векторе. Очищенный гибридный токсин оказался чрезвычайно токсичным в отношении клеток, несущих на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, и не действовал на клетки, у которых эти рецепторы отсутствовали и которые погибали под действием природного токсина. Интернализация (транслокация внутрь клеток) гибридного токсина была опосредована субъединицами р55 и р70 рецептора интерлейкина 2. Таким образом, в результате действия гибридного токсина на популяцию клеток, часть из которых экспрессирует на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, происходит избирательная гибель именно этих клеток.
В организме большинство покоящихся T-клеток и T-клеток памяти не экспрессируют на своей поверхности высокоаффинных рецепторов интерлейкина 2, тогда как T-клетки, стимулированные аллоантигенами, содержат такие рецепторы. Поэтому внутрибрюшинное введение гибридного токсина крысам с экспериментальным артритом – заболеванием, обусловленным патологической активацией T-клеток, снижало симптомы заболевания. Гибридный токсин существенно уменьшал у мышей и реакции отторжения трансплантата.
Вслед за этими пионерскими работами последовала целая серия исследований, направленных на создание аналогичных систем адресной доставки различных цитотоксических полипептидов. В процессе дальнейшего усовершенствования системы адресной доставки псевдомонадного токсина с использованием интерлейкина 2 в качестве лиганда отказались от полного удаления адресного домена токсина и ограничились его инактивацией путем введения в ген токсина четырех сайт-специфических мутаций. Молекулы такого гибридного токсина оказались в 10–100 раз более эффективными цитотоксическими агентами против клеток человека и обезьян, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы для интерлейкина 2, а также обладали значительно большим временем полужизни в крови мышей in vivo по сравнению с ранее полученной конструкцией.
На основе псевдомонадного токсина были созданы гибридные токсины, содержащие в качестве лигандов полипептидные цепи интерлейкина 4, интерлейкина 6, трансформирующего фактора роста типа и инсулиноподобного фактора роста I. Для всех этих гибридных белков была показана высокоспецифическая цитотоксичность в отношении опухолевых клеток (включая клетки миеломы человека), обладающих соответствующими рецепторами. Использование в гибридном токсине в качестве лиганда части полипептидной цепи CD4 – гликопротеина поверхности T-клеток, который является рецептором вируса ВИЧ и взаимодействует с его гликопротеином gp120, позволило избирательно поражать T-клетки, зараженные вирусом ВИЧ и экспрессирующие на своей поверхности вирусный белок gp120.
Тот же принцип подавления инфекции, вызванной вирусами ВИЧ, растворимыми рецепторами CD4 был использован при конструировании гибридных белков, объединяющих части полипептидных цепей CD4 с константными частями тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов человека. При этом в процессе объединения генов были удалены последовательности нуклеотидов, кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены CD4, а также вариабельную часть полипептидных цепей иммуноглобулинов. Образующиеся гибридные молекулы, названные иммуноадгезинами , за счет константной части молекулы иммуноглобулина приобретали повышенную стабильность в организме и, кроме того, сохраняли специфические свойства, опосредуемые константными частями иммуноглобулинов: связывание Fс-рецептора и белка A, способность к фиксации комплемента и перенос через плацентарный барьер. Совокупность всех этих свойств давала возможность иммуноадгезинам эффективно прерывать инфекцию T-клеток вирусом ВИЧ-I, блокируя как сам вирус, так и зараженные им клетки, экспрессирующие на своей поверхности вирусный антиген gp120.
Дальнейшее усовершенствование генно-инженерных конструкций на основе псевдомонадного экзотоксина А произошло после того, как в качестве адресной части гибридного токсина стали использовать вариабельные домены моноклональных антител к компоненту p55 рецептора интерлейкина 2 человека. В этом рекомбинантном белке с помощью 15-звенного пептидного линкера аминокислот соединяли вариабельный домен тяжелой цепи этого иммуноглобулина с вариабельным доменом его легкой цепи, а С-конец легкой цепи – с N-концом укороченного псевдомонадного токсина (см. рис. II.22,г ). Такие молекулы гибридного токсина также оказались высокоспецифичными цитотоксическими агентами по отношению к лейкозным клеткам человека, экспрессирующим на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2.
Разработанный подход продемонстрировал возможность использования специфических антител в качестве адресных частей гибридных токсинов. Это дает в руки исследователей универсальный способ адресной доставки токсинов, который в будущем позволит оказывать цитотоксическое действие на любые группы клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены, т.е. значительно расширить количество мишеней для химиотерапевтических воздействий с использованием рекомбинантных белков.
Помимо псевдомонадного экзотоксина A в качестве действующего начала в гибридных токсинах успешно применяли дифтерийный токсин, фактор некроза опухолей и A-цепь рицина. Поскольку A-белок избирательно взаимодействует с константными (Fс) частями иммуноглобулинов класса G многих млекопитающих, такой гибридный токсин в паре с иммуноглобулином, полученным против какого-либо антигена на поверхности клеток, избирательно связывается с этими клетками и убивает их. Такие иммунотоксины являются еще одним потенциальным противоопухолевым агентом и могут быть использованы против клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены.
Рис. II.23. Использование гибридного белка для регуляции экспрессии гена
Методы генной инженерии открывают безграничные возможности конструирования новых белков путем объединения в разных комбинациях различных функциональных доменов полипептидных цепей. Получение гибридных токсинов направленного действия иллюстрирует возможности такого подхода в белковой инженерии. В качестве последней иллюстрации возможностей этой группы методов рассмотрим гибридный белок как новый регулятор активности генов. При конструировании такого белка методами генной инженерии был заменен ДНК-связывающий домен в рецепторе глюкокортикоидных гормонов на соответствующий домен LexA-репрессора E. coli (рис. II.23).
Введение операторной последовательности гена lexA в область промотора глобинового гена (или других генов) приводило к активации промотора под действием гибридного белка в присутствии дексаметазона – синтетического гормона, взаимодействующего с рецептором глюкокортикоидов. Таким образом, в новом генетическом окружении последовательность нуклеотидов оператора гена lexA E. coli функционировала в качестве энхансера транскрипции в присутствии гибридного белка-активатора, узнающего эту последовательность. Результаты работы демонстрируют возможность создания новых белков – регуляторов активности генов путем комбинирования известных функциональных доменов.
Развитие белковой инженерии во многом сдерживается недостатком знания о структурно-функциональных взаимоотношениях в белках, что обусловлено сложностью объекта исследования. Многочисленные работы, направленные на изучение таких связей, как правило, носят эмпирический характер и завершаются локализацией аминокислот, существенных для функционирования активных центров ферментов. Поэтому основная задача белковой инженерии – по известной последовательности аминокислотных остатков получить белок с заданными свойствами – в настоящее время еще далека от своего разрешения. Тем не менее, уже сейчас иногда удается целенаправленно изменять некоторые свойства существующих ферментов путем замен небольшого числа аминокислотных остатков их полипептидных цепей с помощью направленного мутагенеза.
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Ефимов Григорий Александрович. Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF: диссертация... кандидата биологических наук: 03.01.03 / Ефимов Григорий Александрович;[Место защиты: Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгарда РАН].- Москва, 2015.- 122 с.
Введение
Обзор литературы 9
1. История открытия tnf 9
2. Суперсемейство tnf 10
3. Структура системы tnfnfr 12
4. Функции tnf 15
5. Роль TNF в патогенезе ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний 16
6. Терапевтическая блокировка tnf 18
7. Побочные эффекты и ограничения антиnf терапии 23
8. Новые подходы и перспективы tnf блокировки 25
Материалы и методы исследования 29
1. Получение и характеристика нового верблюжьего одно доменного антитела к tnf человека 29
Экспрессия и очистка однодоменного антитела Vhh41 29
Оценка связывания антитела Vhh41 с TNF человека методом ИФА 30
Изучение взаимодействия Vhh41 и TNF человека методом поверхностного плазменного резонанса 31
Исследования способности Vhh41 блокировать TNF человека 31
2. Конструирование, получение и характеристика гибридных белков флуоресцентных сенсоров TNF 32
Конструирование генов, кодирующих сенсоры TNF. 32
Экспрессия и очистка флуоресцентных сенсоров TNF. 33
Анализ взаимодействия Vhh41-K с рекомбинантным TNF. 34
Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-KTNFin vitro и in vivo . З5
Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo 36
Прижизненное изучение экспрессии TNF с помощью полученного флуоресцентного сенсора...39
3. Получение и характеристика одноцепочечного АНТИNF антитела 40
Изучение мышиного моноклонального антитела F10 40
Конструирование и экспрессия одноцепочечного антитела ahT-4 41
Измерение биологической активности одноцепочечного антитела ahT-4 42
4. Получение и характеристика химерного антиnf антитела 43
5. Конструирование, получение и характеристика биспецифических антител А9 и МА9 43
Конструирование, экспрессия и очистка антител А9 и тА9 43 Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека методом
поверхностного плазменного резонанса 44
Цитотоксический тест 45
Цитофлуориметрия 45
Оценка способности биспецифического антитела А9удерживать TNF человека на
поверхности макрофагов 45
6. Сравнительная оценка эффективности системной и селективной блокировки макрофагального TNF 46
Модель острой гепатотоксичности, индуцированной введением JIIJC/D-галактозамина 46
Результаты и обсуждение 48
1. Получение и характеристика нового рекомбинантного одно доменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность 50
Создание генетической конструкции, кодирующей рекомбинантное однодоменное антитело
Экспрессия и очистка рекомбинантного однодоменного антитела Vhh41 52
Анализ взаимодействия однодоменного антитела Vhh41 с TNF человека 53
Анализ способности антитела Vhh41 блокировать биологическую активность TNF человека.54
2. Конструирование, получение и характеристика молекулярных сенсоров TNF для прижизненного изучения экспрессии tnf на основе одно доменных рекомбинантных антител и красного флуоресцентного белка 56
Получение генетических конструкций, кодирующих флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-Ku
контрольные гибридные белки 56
Экспрессия и очистка флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. 57
Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-К с рекомбинантным TNFмыши
и человека 58
Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-Kin vitro и in vivo. 61
Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo 66
Прижизненное изучение экспрессии TNFс помощью полученного флуоресцентного сенсора... 69
3. Получение и характеристика рекомбинантного одноцепочечного антитела, блокирующего биологическую активность TNF 72
Измерение активности мышиного моноклонального антитела F10 72
Конструирование одноцепочечного антитела на базе вариабельных фрагментов легкой и
тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела F 10 74
Измерение активности одноцепочечного антитела ahT-4 75
4. Разработка и анализ химерного антитела против TNF человека
Сравнение кинетики взаимодействий химерного антитела 13239 и инфликсимаба с
рекомбинантным TNF человека 77 Сравнение нейтрализующей активности химерного антитела 13239 с активностью
инфликсимаба in vitro 79
Анализ активности химерного антитела 13239 in vivo 80
5. Конструирование, получение и характеристика селективного б локатора tnf, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда 82
Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител 82
Взаимодействие антител А9 и тА9 срекомбинантным TNF человека 86
Блокировка антителами А9 и тА9 TNF-зависимой цитотоксичности in vitro 87
Анализ связывания антител А9 и тА9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с
поверхностной молекулой F4/80 89
Удержание эндогенно продуцируемого TNF человека на поверхности макрофагов
биспецифическим антителом А9 93
6. Физиологически значимая селективная блокировка tnf, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда in vivo 96
Сравнительная оценка эффективности направленной блокировки TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагалъного ряда, и системной блокировки TNF в модели острой
гепатотоксичности 96
Заключение 99
Список литературы 100
Роль TNF в патогенезе ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний
Первый опыт антицитокиновой терапии был осуществлен в 1985 г., когда мышам была введена поликлональная антиNF кроличья сыворотка, что предотвратило развитие у них летальной гепатотоксичности, индуцированной введением ЛПС . Аналогичные результаты были получены на обезьянах: павианы, которым вводилось моноклональное мышиное антитело против TNF человека, выжили, после внутривенной инъекции летальной дозы Е. coli [ 104].
Первый терапевтический блокатор TNF был разработан на основе высокоаффинного мышиного моноклонального антитела А2, полученного из мышей, иммунизированных TNF человека . Поскольку антитела других видов имеют существенные отличия в аминокислотной последовательности, они непригодны для долговременного терапевтического использования в людях. Поэтому методами генной инженерии мышиные константные домены тяжелой и легкой цепей были заменены на человеческие. Вариабельные участки, связывающие антиген, при этом остались неизмененными . Подобные антитела называются химерными. Впоследствии это первое терапевтическое антитело против TNF получило международное непатентованное название - инфликсимаб.
Одной из наиболее очевидных областей применения антиNF терапии было лечение сепсиса. Однако клинические исследования не показали значительных результатов , что, по всей видимости, связанно с тем, что к моменту развития клинической картины сепсиса необратимые сигнальные каскады уже запущены.
К этому моменту было накоплено уже много фактов, говорящих об участии TNF в патогенезе ревматоидного артрита, поэтому это заболевание было выбрано в качестве следующей потенциальной мишени для антиNF терапии. Пилотные исследования инфликсимаба в ревматоидном артрите дали многообещающие результаты , а дальнейшее рандомизированное двойное слепое исследование подтвердило эффективность антиNF терапии в терапии аутоиммунных заболеваний . Однако после повторных инъекций у некоторых пациентов вырабатывались антитела, специфичные к мышиным аминокислотным последовательностям в вариабельных доменах, что снижало эффективность терапии.
Двойное слепое рандомизированное исследование показало, что инфликсимаб обладает синергическим эффектом с небольшими дозами метотрексата -цитостатического препарата, использующегося для монотерапии РА. В сочетании эти два препарата обладают большей эффективностью, а иммуногенность инфликсимаба снижается . Последовавшие II/III фазы клинических испытаний привели к одобрению инфликсимаба для терапии РА .
Механизм действия инфликсимаба обусловлен, в основном, связыванием растворимого TNF в системном кровотоке и в местах локальной гиперэкспрессии (синовиальная полость при РА). Но, кроме того, инфликсимаб способен связываться с трансмембранной формой TNF и вызывать лизис клеток, несущих его на своей поверхности через механизм антитело-зависимой цитотоксичности .
АнтиNF терапия разрывает патологический сигнальный каскад и приводит к снижению воспалительной реакции, но, кроме того, она способна сбалансировать дисрегулированную иммунную систему. На фоне введения ингибиторов TNF сдвигается баланс Т-эффекторных и Т-регуляторных клеток .
АнтиNF терапия не является этиотропной терапией и теоретически должна применяться в течение всей жизни больного, однако в некоторых случаях удается добиться стойкой ремиссии, которая сохраняется и после отмены антиNF терапии .
Блокаторы TNF показали свою эффективность и при терапии других аутоиммунных и воспалительных заболеваний: было показано, что TNF играет значимую роль в патогенезе болезни Крона - он сверхэкспрессируется в воспаленных участках кишечника . Предварительные успехи в терапии болезни Крона, резистистентной к стандартной терапии, с помощью инфликсимаба позднее подтвердились в рандомизированных клинических испытаниях в результате чего инфликсимаб был одобрен для терапии и этого заболевания.
Патогенез анкилозирующего спондилита (болезни Бехтерева), еще одного хронического системного аутоиммунного заболевания с преимущественным поражением суставов, также обусловлен сверхэкспрессией TNF. Клинические испытания инфликсимаба оказались успешными и для этого заболевания . Кроме того, антиNF терапия показала высокую эффективность в лечении псориаза и псориатического артрита .
На сегодняшний момент инфликсимаб и другие блокаторы TNF утверждены в качестве терапевтических агентов для следующих аутоиммунных заболеваний: ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, анкилозирующий спондилит, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, псориатический артрит. Кроме этого, антагонисты TNF показали положительные результаты в терапии саркоидоза , гранулематоза Вегенера , болезни Бехчета и других хронических заболеваний.
Указания на то, что TNF играет роль в патогенезе рассеянного склероза , были подтверждены экспериментами на лабораторных животных. Введение TNF усиливало симптоматику экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс , а введение антиNF антитела предотвращало развитие этого заболевания .
Однако клинические исследования по терапии рассеянного склероза инфликсимабом и еще одним блокатором TNF - ленерцептом (растворимый TNFR1) не дали значимого клинического ответа . Более того, у некоторых пациентов
Модельное аутоиммунное заболевание, патогенез которого сходен с патогенезом множественного склероза. наблюдалось усиление клинических симптомов заболевания и увеличение клеточности и уровня иммуноглобулинов в спинномозговой жидкости, увеличение количества очагов при магнитно-резонансном исследовании .
Успех применения инфликсимаба дал толчок к созданию новых молекул, способных блокировать передачу сигнала через TNFR. Кроме того, мышиные последовательности в вариабельных доменах тяжелой и легкой цепи инфликсимаба вызывали у части пациентов продукцию вторичных антител, которые блокировали действие инфликсимаба и делали больных невосприимчивыми к терапии. Чтобы преодолеть это ограничение, был выбран путь создания ингибиторов с полностью человеческими аминокислотными последовательностями.
На сегодняшний день, кроме инфликсимаба, для клинического применения одобрены четыре антагониста TNF (см. Рис. 2):
Этанерцепт - рекомбинантный ингибитор TNF, сконструированный на основе растворимого TNFR2. В основу его разработки легли данные о том, что в организме человека присутствует растворимая форма второго рецептора TNF . «Слущиваемый» под действием металлопротеаз TNFR2 является дополнительным звеном регуляции активности TNF . Этанерцепт представляет собой димер внеклеточной части TNFR2, генетически слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина IgGl. Соединение с константным участком антитела существенно увеличивает период полужизни препарата в системном кровотоке за счет рециркуляции белка через FcRn рецептор . Нейтрализующая активность гибридного белка была продемонстрирована как в in vitro, так и в in vivo опытах , а позже подтверждена в клинических испытаниях на пациентах, страдающих ревматоидным артритом .
Однако при терапии воспалительных заболеваний кишечника этанерцепт, в отличии от инфликсимаба, не показал терапевтической эффективности . Экспериментальный блокатор TNF онерцепт, полученный на основе другого рецептора TNF - TNFR1 (р55), несмотря на обнадеживающие пилотные клинические исследования в рандомизированном плацебо-контролируемом двойном слепом исследовании, также не показал эффективности в терапии болезни Крона . Исследования in vitro, в котором изучались Т-лимфоциты из собственной пластинки слизистой больных, страдающих болезнью Крона, показали, что тогда как и инфликсимаб, и этанерцепт блокируют TNF, только инфликсимаб связывается с Т-клетками в очаге поражения и индуцирует в них апоптоз . Этим может объясняться различие эффективности блокаторов на основе антител и рекомбинантных рецепторов в воспалительных заболеваниях кишечника.
Изучение взаимодействия Vhh41 и TNF человека методом поверхностного плазменного резонанса
Генетическая конструкция, кодирующая биспецифическое антитело А9 была собрана ГЩР реакцией с 4 праймерами аналогичной, описанной выше для гена одноцепочечного антитела ahT-4. Получившаяся в результате последовательность состояла из: гена однодоменного антиNF антитела , затем последовательности, кодирующей линкер вида (Gly4Ser)3, и гена одноцепочечного анти-Р4/80 антитела (любезно предоставлен С.Гордоном и М.Стейси). Сайты узнавания рестриктаз Ncol и Xhol были включены в последовательность прямого и обратных праймеров соответственно. После рестрикции ПЦР продукта и клонирования его в экспрессионный вектор pET-28b (Novagen) последовательность, кодирующая полигексидиновую метку оказалась на 3 конце в той же рамке считывания. Для получения контрольного антитела шА9 мутантный ген анти-Г4/80 scFv, содержащий вместо CDR последовательностей глицин-сериновые вставки был синтезирован de-novo (Geneart, Германия) и клонирован вместо нативного гена анти-F4/80 (см. Рис. 31В).
Экспрессионные вектора, несущие вставки, кодирующие А9 и шА9 были использованы для трансформации клеток Е.coli штамма Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen). Лучшие клоны продуценты были отобраны методом иммуноблотинга колоний с использованием никель-конъюгированной пероксидазы (Pierce, 15165). Бактериальные культуры наращивались в среде LB, содержащей 50 цг/мл карбенициллина (Sigma -С1389) и 50 цг/мл хлорамфеникола (Sigma - С1863) до логарифмической фазы, а затем экспрессия индуцировалась 0.2 мМ ИПТГ. Через 4 часа культуры подвергались центрифугированию при 3200 g в течение 30 мин. Осадки замораживались а затем ресуспензировась в лизирующем буфере (50 мМ TrisHCl, 300 MMNaCl, 5% глицерин, 0.5% детергента Triton Х-100, 10000 Ед/мл лизоцим, 10 мМ Р-меркаптоэтанол) а потом разрушались с помощью утразвукового гомогенизатора. Лизаты центрифугировались при 17000 g в течение 40 мин., супернатанты отбирали и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 цм. БиспецифическЫ антитела А9 и тА9 очищались из просветленных супернатантов на хроматографической колонке, содержащей агарозу, конъюгированную с Ni-нитрилоуксусной кислотой (Invitrogen R90115). Аффинную хроматографию проводили по протоколу производителя. Полученный элюат концентрировали, диализовали против фосфатно-солевого буфера, с последующей фильтрацией через фильтр 0.22 мкм. Концентрация белка в растворе измерялась с помощью реакции с 2,2 -бицинхониновой кислотой (набор PIERCE 23225) по протоколу фирмы производителя. Гомогенность полученного препарата была проверена методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с последующей окраской кумасси.
Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека методом поверхностного плазмонного резонанса.
Сравнение аффинностей и кинетик взаимодействия антител А9 и шА9 с рекомбинантным TNF человека проводилось на приборе ProteOn XPR36 (Bio-Rad). В ходе измерения всех взаимодействий использовался фосфатно-солевой буфер, имеющий рН=7,4, в который был добавлен детергент Tween 20 до концентрации 0,005%, температура поверхности чипа составляла 25 С. Рекомбинантный TNF человека был экспрессирован в Е. coli по описанной ранее методике . Антитела А9 и тА9 в концентрации 50 нМ иммобилиз провались через амино-группу на поверхности биочипа с модифицированной альгинатной полимерной поверхностью (Bio-Rad 176-5011). Затем аналит (TNF человека) в пяти двукратно убывающих концентрациях (50 -3 нМ) наносились в пять параллельных каналов. В шестой канал вводился буфер, не содержащий антитела, для нормировки. Анализ полученных сенсограмм проводился в программе ProteOn Manager (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.
В экспериментах с перитонеальными макрофагами клетки перитонеальной полости выделялись из мышей дикого типа (C57BL/6) и сразу же окрашивались с использованием антител, коъюгированных с флуорохромами. Для получения костномозговых макрофагов костный мозг выделялся, после чего клетки культивировались в течение 10 дней в кондиционный среде (полученной на линии L929), затем клетки снимались с пластика ледяным фосфатным буфером.
Перед окрашиванием Fc-гамма рецептор блокировался, затем клетки инкубировались с антителами А9 или тА9 или буфером, после чего клетки отмывались и окрашивались одним из трех способов: 1) поликлональными кроличьими антителами к hTNF-VnH, затем со вторичными антителами к IgG кролика, конъюгированными с флуорохромом. 2) моноклональными мышиными антителами к гексагистидиновой последовательность (Novagen - 70796), затем со вторичными антителами к IgG мыши, конъюгированными с флуорохромом. 3) к клеткам добавлялся рекомбинантный TNF человека, а затем моноклональные антиNF антитела (Miltenyi Biotec - clone: сА2), меченные флуорохромом.
Кроме того клетки окрашивались анти-Р4/80 и анти-CD 1 lb антителами, конъюгированными с флуорохромами. Образцы анализировались либо на приборе F ACS Aria (BDBiosciences) или Guava EasyCyte 8HT (Millipore) а затем полученные данные обрабатывались с помощью программы FlowJo (Treestar Inc.).
Оценка способности биспецифического антитела А9 удерживать TNF человека на поверхности макрофагов.
Перитонеальные макрофаги из мышей, продуцирующих TNF человека, выделялись и рассаживались в количестве 100 тыс. клеток на лунку в 96-луночные культуральные планшеты. Клетки инкубировались в течение 2 ч при 37С, 5%СОг, после чего не прикрепившиеся клетки смывались теплым фосфатным буфером. Затем клетки икубировались в течение ночи при 37С, 5% СОг. После промывки 200 мкл теплой среды DMEM клетки инкубировались с антителами А9 в концентрации 2мкг/мл или со средой DMEM 30 минут при 37С. После еще одной промывки клетки стимулировались ЛПС (Sigma, L2630) в концентрации 100 нг/мл. Через 4 ч культуральные супернатанты собирались и концентрация TNF человека измерялась с помощью набора для ИФА (eBioscience, 88-7346) по протоколу производителя.
Костный мозг из мышей, продуцирующих TNF человека выделялся, после чего клетки культивировались в течение 10 дней в кондиционный среде (полученной на линии L929), затем клетки снимались с пластика ледяным фосфатным буфером. Количество живых клеток подсчитывалось и они рассаживались на 96 луночные планшеты в концентрации 50000 клеток/лунку. Затем к клеткам добавлялось 250 цМ антитела А9 или однодоменного антитела hTNF-VffH или пустая среда (DMEM). Клетки инкубировались с антителами в течение 30 мин. Затем лунки промывались фосфатно-солевым буфером. После этого продукция TNF стимулировалась ЛПС (Sigma - L2630) в концентрации 100 нг/мл. Через 4 часа супернатанты собирались, концентрация TNF в них измерялась с помощью цитотоксического теста на линии мышиной фибросаркомы L929 по протоколу аналогичному описанному выше.
Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-KTNFin vitro и in vivo
На основании экспериментальных данных, полученных на линиях мышей, в которых ген Tnf удален в отдельных клеточных популяциях , была сформулирована гипотеза о возможных различных функциях TNF, производимого разными типами иммуноцитов. Так недавно было показано, что в модели экспериментальной туберкулезной инфекции TNF, продуцируемый Т-лимфоцитами, но не миелоидными клетками, имеет уникальную защитную функцию . Кроме того в нашей лаборатории получены данные, указывающие на патогенные свойства TNF из миелоидных клеток при аутоиммунных заболеваниях . Терапевтически применяемая полная блокировка ПМБне учитывает этих особенностей. В рамках развития данной гипотезы было выбрано специфическое ингибирование TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда, которое могло бы иметь существенное преимущество перед системной блокировкой этого цитокина. В частности, интактный сигнал от TNF, производимого В- и Т- лимфоцитами, мог бы снизить частоту побочных эффектов, а, кроме того, сделать антиNF терапию эффективной в тех болезнях, для которых ранее блокаторы TNF не показали клинической эффективности, или даже вызывали усиление симптоматики. Кроме того, такой подход может потенциально снизить необходимую дозу за счет адресной доставки к клеткам-продуцентам.
Для проверки этого предположения мы сконструировали и испытали биспецифическое антитело, которое одной своей частью связывается с поверхностью макрофагов за счет взаимодейсвия с трансмембранной молекулой F4/80, а второй специфичностью захватывает и блокирует производимый ими TNF.
Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител. Биспецифическое антитело - селективный блокатор макрофагального TNF -получило название А9. Для создания кодирующей его генетической конструкции были использованы однодоменное блокирующего антиNF антитело hTNF-VffH и одноцепочечное антитело (scFv) против макрофагального поверхностного маркера F4/80 (любезно предоставленное С. Гордоном (Оксфордский университет, Великобритания) и М. Стейси (университет Лидса, Великобритания). Последовательности, кодирующие оба антитела были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клонированы в экспрессионный вектор таким образом, что они оказались в одной рамке считывания, а между ними образовалась нуклеотидная последовательность, кодирующая гибкий глицин-сериновый линкер (GSGGGGSG). На С-конце последовательности располагается последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер, для последующей очистки белка (Рис. 31).
Дизайн биспецифического антитела А9, схематическое изображение его механизма действия, строение генетических конструкций, кодирующих биспецифическое антитело А9 и контрольный системный блокатор TNF -антитело тА9. (А) Биспецифическое антитело А9 состоит из однодоменного антитела (VHH) против TNF человека и одноцепочечного антитела (scFv) против поверхностной молекулы F4/80, экспрессирующейся на моноцитах и макрофагах. (Б) Принцип селективной блокировки TNF, производимого макрофагами: А9 связывется с поверхностью макрофагагов и захватывает высвобождаемый с их поверхности TNF, предотвращая его попадание в системную циркуляцию. (В) Схема генетической конструкции биспецифического антитела А9 и контрольного системного блокатора TNF - тА9. Ген однодоменного антиNF антитела сопровождается последовательностью, кодирующей гибкий глицин-сериновый линкер, а затем геном одноцепочечного антитела против F4/80. Затем следует последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер для аффинной очистки. Контрольное антитело тА9 имеет аналогичную последовательность за исключением того, что 6 гипевариабельных участков анти-Р4/80 антитела заменены на последовательности вида (Gly3Ser)n, что препятствует связыванию антитела с поверхностью макрофагов и превращает его в системный ингибитор TNF.
Для изучения эффектов специфической блокировки TNF, производимого макрофагами, был необходим контрольный системный блокатор. Чтобы избежать эффектов связанных с различиями в аффинности антител, было решено использовать блокатор имеющий аналогичный А9 TNF-связывающий участок. А для того, чтобы исключить влияние других факторов, в частности изоэлектрической точки и молекулярной массы, которая может влиять на время полувыведения, контрольное антитело должно быть максимально приближено по первичной аминокислотной последовательности к изучаемому. Поэтому нами было сконструировано контрольное антитело - тА9, имеющее ту же структуру и аминокислотную последовательность, что и А9 за исключением того, что 6 его гипервариабельных участков в анти-Р4/80 scFv заменены на последовательности вида (Gly3Ser)n, той же длины, что исходные CDR участки (см. Рис. 31 В).
Оба антитела были экспрессированы в бактериальной системе и очищены методом аффинной хроматографии.
Размер антитела А9, определенный по электрофоретической подвижности и по данным ВЖЕХ, соответствовал расчетной молекулярной массе - 45 кДА (Рис. 32). хроматографии. Слева - значения молекуляного веса белков. (Б) Хроматограмма биспецифического антитела А9 (отмечена красным цветом), наложенная на хроматограмму маркеров молекулярной массы. (В) Функция зависимости времени прохождения молекулы в зависимости от молекулярной массы. Расчетная молекулярная масса биспецифического антитела А9 составила 43,4 кДа.
Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека. Кинетика взаимодействия антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека измерялась методом поверхностного-плазмонного резонанса. Для этого оба антитела в концентрации 50 нМ были иммобилизованы на поверхности сенсорного чипа, после чего рекомбинантный TNF человека в серийных разведениях 50-3 нМ был нанесен в качестве аналита, а кинетика взаимодействия измерялась на приборе ProteOn XPR36. Оба антитела показали высокую аффинность: Kd А9 и тА9 составила 85 и 95 пМ соответственно. Это подтверждает, что внесенные мутации не повлияли на связывание с TNF. Кроме того оба антитела обладали сходными параметрами скорости связывания (Kforward, on-rate) и скорости диссоциации (Kreverse, off-rate) - приведены на Рис. 33 и в Таб. 3. Малая скорость диссоциации должна позволить антителу А9 удерживать связанный TNF.
Получение и характеристика нового рекомбинантного одно доменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность
Кинетика взаимодействия антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека измерялась методом поверхностного-плазмонного резонанса. Для этого оба антитела в концентрации 50 нМ были иммобилизованы на поверхности сенсорного чипа, после чего рекомбинантный TNF человека в серийных разведениях 50-3 нМ был нанесен в качестве аналита, а кинетика взаимодействия измерялась на приборе ProteOn XPR36. Оба антитела показали высокую аффинность: Kd А9 и тА9 составила 85 и 95 пМ соответственно. Это подтверждает, что внесенные мутации не повлияли на связывание с TNF. Кроме того оба антитела обладали сходными параметрами скорости связывания (Kforward, on-rate) и скорости диссоциации (Kreverse, off-rate) - приведены на Рис. 33 и в Таб. 3. Малая скорость диссоциации должна позволить антителу А9 удерживать связанный TNF.
Кинетика взаимодействия биспецифического антитела А9 и контрольного антитела тА9 с рекомбинантным TNF человека. (А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) рекомбинантного TNF человека в концентрациях 50 нМ - 3 нМ с сенсорным чипом, на котором были иммобилизованы биспецифическое антитело А9 и контрольное антитело тА9. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (Б) Для каждой группы сенсограмм были расчитаны значения скорости связывания (оп-rate), скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграмме изоаффиности. Диагональные линии соответсвуют указанным значениям константы диссоциации.
Для оценки сравнительной активности антитела А9 в ингибировании биологических эффектов TNF проводился цитотоксический текст на линии мышиной фибросаркомы L929. К постоянным концентрациям рекомбинантного TNF человека и актиномицина-D добавлялись серийные разведения антител А9 и тА9. Согласно полученным данным антитела А9 и тА9 имеют близкую антиNF активность (Рис. 34 А). Кроме того было подтверждено, что активность биспецифического антитела А9 соответствует активности однодоменного антиNF антитела hTNF-VffH, которое входит в состав А9 и тА9 (Рис. 34 Б). 10 10 10
АнтиNF активность биспецифического антитела А9, контрольного антитела mA9 и однодоменного антитела hTNF-VffH. (А) Сравнение активности биспецифического антитела А9 и контрольного антитела тА9. Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антител А9 и тА9. (Б) Сравнение активности биспецифического антитела А9 и однодоменного антитела hTNF-VnH. Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антител А9 и hTNF-VHH.Сравнение проводилось в молярных концентрациях для того, чтобы исключить влияния различий в молярной массе на определяемую активность антитела.
Анализ связывания антител А9 и тА9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с поверхностной молекулой F4/80.
Способность биспецифического антитела А9 специфически связываться с поверхностью макрофагов была оценена методом проточной цитофлуориметрии. Для этого клетки, выделенные из перитонеальной полости, инкубировались с антителами А9, после чего проводилось окращивание на макрофагальные маркеры CD1 lb и F4/80, одновременно осуществлялось специфическое окрашивание на биспецифическое антитело А9 через антитела к VHH ИЛИ антитела к полигистидиновой метке. Затем образцы подвергались проточной цитофлуориметрии и анализу.
Эти эксперименты показали, что биспецифическое антитело А9 способно связываться с поверхностью перитонеальных клеток, экспрессирующих F4/80 и CD1 lb на своей поверхности (моноциты и макрофаги) (Рис. 35 А - Г). В то же время, А9 не связывается с клетками перитонеальной полости, не имеющими этих маркеров (преимущественно лимфоциты) (Рис. 35 Д и Е). Снижения уровня параллельного анти-F4/80 окрашивания при добавлении антитела А9 за счет конкуренции двух антител за связывание с мишенью подтверждает, что А9 специфически взаимодействует именно с этой молекулой на поверхности клеток (Рис. 35 Ж и 3).
Также используется название Мас-1. Составной элемент рецептора СЗ компонента системы комплемента. У мышей экспрессируется на моноцитах, макрофагах и клетках микроглии. биспецифическое антитело
Клетки перитонеальной полости инкубировались с биспецифическим антителом А9 (изображено красным цветом) или без него (изображено синим цветом), а затем подвергались окрашиванию флуоресцентно меченными антителами к поверхностным маркерам, специфичным для клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также антителами, специфичными к А9. Затем полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А, В, Д, Ж) окрашивание через антитела к VHH домену. (Б, Г, Е, 3) окрашивание через антитела к полигексидиновой последовательности. (А, Б) биспецифическое антитело А9 связывается с клетками, отобранными по высокому уровню экспрессии F4/80 и CD1 lb (макрофаги). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (В, Г) то же самое в форме гистограммы рассеяния. По горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси значение флуоресценции в канале окрашивания на F4/80. (Д, Е) -биспецифическое антитело А9 не связывается с клетками перитонеальной полости, не экспрессирующими F4/80 и CD1 lb (лимфоциты). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Ж, 3) -инкубация с биспецифическим антителом А9 снижает интенсивность окрашивания на F4/80. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на F4/80, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события.
Костномозговые макрофаги инкубировались с биспецифическим антителом А9 (изображено красным цветом), без него (изображено синим цветом), или с контрольным антителом тА9 (изображено черным цветом) а затем подвергались окрашиванию антителами, специфичными к А9/тА9. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А) биспецифическое антитело А9 специфически связывается с костномозговыми макрофагами. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Б) контрольное антитело шА9 неспособно связываться с костномозговыми макрофагами. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на шА9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события.
Кроме того, в дополнительных цитофлуориметрических экспериментах было показано, что антитело А9, будучи прикрепленным к поверхности макрофагов, способно одновременно связывать экзогенно добавленный TNF человека (Рис. 37). Что подтверждает, что обе субъединицы биспецифического антитела функционально активны одновременно, и что связывание двух антигенов одновременно стерически возможно.
Клетки перитонеальной полости инкубировались с биспецифическим антителом А9 (изображено красным цветом) или без него (изображено синим цветом), затем с рекомбинантным TNF человека, после чего подвергались окрашиванию флуоресцентно-меченными антителами к поверхностным маркерам, специфичным для клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также антителами, специфичными к TNF человека. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А) биспецифическое антитело А9, способно удерживать TNF человека на поверхности макрофагов (клеток, отобранных по высокому уровню экспрессии F4/80 и CD1 lb). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на TNF, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Б) те же данные в форме гистограммы рассеяния. По горизонтальной оси отложены значения флуоресценции в канале окрашивания на TNF, по вертикальной оси значения флуоресценции в канале окрашивания на F4/80.
БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, направление молекулярной биологии и биоинженерии, в задачи которого входят целенаправленное изменение структуры природных белков и получение новых белков с заданными свойствами. Белковая инженерия возникла в начале 1980-х годов, когда были разработаны методы генетической инженерии, позволившие получать различные природные белки с помощью бактерий или дрожжей, а также определённым образом изменять структуру генов и, соответственно, аминокислотную последовательность (первичную структуру) кодируемых ими белков. Исходя из принципов организации белковых молекул, взаимосвязи структуры и функции белков, белковая инженерия создаёт научно обоснованную технологию направленного изменения их структуры. С помощью белковой инженерии удаётся повышать термостабильность белков, их устойчивость к денатурирующим воздействиям, органическим растворителям, изменять лигандсвязывающие свойства. Белковая инженерия позволяет путём замены аминокислот улучшать работу ферментов и их специфичность, изменять оптимальные значения pH, при которых работает фермент, исключать нежелательные побочные активности, устранять участки молекул, ингибирующие ферментативные реакции, повышать эффективность белковых лекарственных препаратов и так далее. Например, замена лишь одного остатка треонина на остаток аланина или пролина позволила в 50 раз повысить активность фермента тирозилтРНК-синтетазы, а благодаря замене 8 аминокислотных остатков так называемая термолизин-подобная протеаза из Bacillus stearothermophilus приобрела способность сохранять активность при 120 °С в течение нескольких часов. К белковой инженерии можно отнести также работы по направленному изменению свойств белков с помощью химических модификаций, например введение фотоактивируемых соединений, изменяющих свойства молекулы под действием света, соединений-меток, позволяющих отслеживать пути перемещения белка в клетке или направлять его к различным компонентам клетки, и тому подобное. Такие работы проводятся преимущественно на рекомбинантных белках, получаемых с помощью генно-инженерных методов.
В белковой инженерии можно выделить два направления: рациональный дизайн и направленная молекулярная эволюция белков. Первое подразумевает использование информации о структурно-функциональных отношениях в белках, получаемой с помощью физико-химических и биологических методов, а также компьютерного молекулярного моделирования, для того чтобы определить, какие именно изменения в первичной структуре должны привести к желаемому результату. Так, для повышения термостабильности белка необходимо определить его пространственную структуру, выявить «слабые» участки (например, аминокислоты, недостаточно сильно связанные со своим окружением), подобрать для них наилучшие варианты замен на другие аминокислоты с помощью молекулярного моделирования и оптимизации энергетических параметров молекулы; после этого подвергнуть мутации соответствующий ген, а затем получить и исследовать мутантный белок. Если этот белок не удовлетворяет заданным параметрам, проводят новый анализ и повторяют описанный цикл. Такой подход наиболее часто используется в случае конструирования искусственных белков (белков de novo) с заданными свойствами, когда на входе имеется новая аминокислотная последовательность, в основном или полностью заданная человеком, а на выходе - белковая молекула с желаемыми характеристиками. Пока, однако, таким образом удаётся получать только небольшие белки de novo с несложной пространственной структурой и вводить в них простые функциональные активности, например металлсвязывающие участки или короткие пептидные фрагменты, несущие какие-либо биологические функции.
При направленной молекулярной эволюции белков с помощью генно-инженерных методов получают большой набор различных мутантных генов целевого белка, которые затем экспрессируют специальным образом, в частности на поверхности фагов («фаговый дисплей») или в бактериальных клетках, с тем, чтобы сделать возможным отбор мутантов с лучшими характеристиками. С этой целью, например, гены нужного белка или его частей встраиваются в геном фага - в состав гена, кодирующего белок, расположенный на поверхности фаговой частицы. При этом каждый индивидуальный фаг несёт свой мутантный белок, обладающий определёнными свойствами, по которым делается отбор. Мутантные гены получают путём «перемешивания» набора генов сходных природных белков различных организмов, как правило, с помощью метода полимеразной цепной реакции, так что каждый получаемый мутантный белок может включать в себя фрагменты многих «родительских» белков. По сути, этот подход имитирует природную эволюцию белков, но только существенно более быстрыми темпами. Основная задача белкового инженера в данном случае заключается в разработке эффективной селектирующей системы, которая позволит отбирать лучшие мутантные варианты белков с нужными параметрами. В случае вышеупомянутой задачи — повысить термостабильность белка - отбор можно вести, например, путём выращивания клеток, содержащих мутантные гены, при повышенной температуре (при условии, что присутствие в клетке мутантного белка увеличивает её термическую устойчивость).
Оба названных направления белковой инженерии имеют одну цель и дополняют друг друга. Так, исследование получаемых с помощью методов молекулярной эволюции мутантных вариантов белков позволяет лучше понять структурно-функциональную организацию белковых молекул и использовать полученные знания для целенаправленного рационального дизайна новых белков. Дальнейшее развитие белковой инженерии даёт возможность решать многие практические задачи по улучшению природных и получению новых белков для нужд медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. В будущем возможно создание белков, обладающих функциями, неизвестными в живой природе.
Лит.: Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12; Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. М., 2004. Т. 1: Генная и белковая инженерия.
